摘要：目的 观察Ki-67启动子内能与细胞核蛋白结合的转录因子Sp1结合位点,探讨肿瘤细胞Ki-67基因高表达机制.方法 提取Hela细胞核蛋白.针对Ki-67启动子内4个潜在Sp1位点区域A1（-198～-172）、A2（-170～-144）、A3（-63～-37）、A4（-14～＋12）,以及没有Sp1结合位点的阴性对照区域C（-117～-91）,设计相应的Sp1一致性寡核苷酸探针和Sp1突变性寡核苷酸探针,凝胶阻滞电泳实验（EMSA）验证Sp1探针与Hela细胞核蛋白的结合活性.结果 EMSA显示A2、A3、A4一致性探针均可以和Hela细胞核蛋白结合,这种结合可以被相应的100倍浓度非标记的一致性探针竞争抑制,不能被100倍浓度的非标记的突变性探针所抑制.出现结合带的反应中加入Sp1抗体后观察到明显的Supershift现象.A1和C相应探针不能和Hela细胞核蛋白发生结合反应.结论 Ki-67启动子-170～-144、-63～-37和-14～＋12区域上存在能与肿瘤Hela细胞核蛋白结合的Sp1结合位点.

摘要：目的:研究雷帕霉素联合紫杉醇对人胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。方法:MTT法检测经雷帕霉素、紫杉醇和雷帕霉素+紫杉醇作用后人胃癌SGC-7901细胞的增殖抑制率,流式细胞术检测细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1alpha,HIF-1α)及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白表达,两因素析因设计方差分析法进行统计分析。结果:雷帕霉素、紫杉醇及雷帕霉素联合紫杉醇处理SGC-7901细胞后细胞增殖抑制率分别为(25.43±1.98)%、(27.28±3.34)%和(53.64±1.99)%,雷帕霉素或紫杉醇单独作用均可抑制细胞增殖,联合作用对细胞增殖抑制率影响极显著,F=57.471,P1.15,雷帕霉素和紫杉醇具有协同作用。雷帕霉素、紫杉醇及雷帕霉素联合紫杉醇处理SGC-7901细胞后细胞凋亡率分别为(16.25±1.86)%、(21.80±3.12)%和(38.60±3.78)%,雷帕霉素或紫杉醇单独作用均可诱导细胞凋亡,两药联用细胞凋亡率显著增加,P=0.016 3;雷帕霉素和紫杉醇具有协同诱导SGC-7901细胞凋亡作用。紫杉醇处理细胞后,HIF-1α及VEGF蛋白相对表达量分别为0.598±0.089和0.420±0.091,VEGF蛋白表达下降,P=0.001;而HIF-1α蛋白表达无明显变化,P=0.434。雷帕霉素处理细胞后,HIF-1α及VEGF蛋白相对表达量分别为0.416±0.034和0.376±0.022,表达均显著下降,P值分别为0.016和0.001;而两药联合处理细胞后,HIF-1α及VEGF蛋白相对表达分别为0.209±0.027和0.156±0.015,均显著降低,F值分别为18.322和25.525,P值均为0.001。2种药物对SGC-7901细胞HIF-1α及VEGF蛋白表达抑制起到了显著的协同作用。结论:雷帕霉素联合紫杉醇可显著抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖,诱导凋亡,2种药物具有协同抗肿瘤作用。

摘要：根据Genebank提供的大鼠HO-1(Hmoxl,血红素加氧酶-1)基因序列,参照RNA干扰序列设计原则,设计针对HO-1的4个RNA干扰序列,定向克隆至表达载体pGPU6-GFP-Neo中,最后采用BamH I和Pst I酶切凝胶电泳鉴定。鉴定结果显示成功合成了荷载HO-1-shRNA的表达载体。

摘要：目的构建含复制蛋白A70（RPA70）基因的短发夹RNA（shorthairpinRNA，shRNA）表达质粒，诱导RNA干扰（RNAinterference，RNAi）。方法根据GenBank中RPA70基因的mRNA序列，设计、合成2条反向重复多聚寡核苷酸序列，退火形成双链DNA。利用分子克隆技术，将含RPA70基因的双链DNA与经双酶切后的载体psi—U6-GFP—Neo连接，构建psi—U6-GFP—Neo—shRNA—RPA70重组质粒，通过DNA测序证实表达质粒构建成功。设空白对照组、阴性对照组及实验组，在脂质体2000的介导下转染食管癌TE-1细胞株，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达情况。结果DNA测序证实含RPA70基因的shRNA表达质粒构建成功。结论成功地构建了重组质粒pSi—U6-GFP—Neo—shRNA—RPA70，为下一步干扰实验奠定了基础。

摘要：目的探讨沉默肝激酶B1（1iverkinaseB1，LKB1）基因对肺癌95一D和H1299细胞侵袭、迁移能力和上皮间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）的影响。方法设计靶向沉默LKB1的shRNA，构建shLKB1重组质粒以及含无关shRNA的shCtd阴性对照质粒，转染肺癌95一D和H1299细胞，Westernblot检测LKB1表达情况，荧光显微镜观察转染效率；Transwell实验和划痕实验检测转染后细胞的侵袭和迁移能力；Western blot检测EMT标志蛋白E一钙黏蛋白（E—cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表达情况。结果成功构建shLKB1重组质粒，并转染人肺癌95-D和H1299细胞。Western blot检测结果显示，与对照组相比，转染组LKB1表达下降，侵袭和迁移能力增强，E—cadhefin表达减少，Vimentin表达增加，差异均具有统计学意义（P〈0．05）。结论沉默抑癌基因LKB1可使肺癌95一D和H1299细胞侵袭和迁移能力增强，并且可能与EMT现象上调有关。