摘要：人类白细胞抗原-E(HLA-E)在多种肿瘤中呈高表达,其与肿瘤患者预后的关系呈现肿瘤类型依赖性。HLA-E主要通过与NK细胞或T细胞上的激活性(NKG2C)或抑制性(NKG2A)受体结合,在调控抗肿瘤免疫应答中发挥重要作用。基于此,靶向HLA-E/NKG2A以阻断HLA-E与NKG2A的相互作用或抑制HLA-E表达,有望成为增强抗肿瘤免疫应答的新策略。鉴于HLA-E的功能特点设计增强型或通用型的T/NK细胞过继免疫疗法,有望提高过继免疫细胞疗法的治疗效果,具有良好的研发和临床应用前景。如何将靶向HLA-E或NKG2A的疗法与其他免疫疗法有效联合,实现更精准的免疫治疗以提高临床治疗效果是目前该方面研发和应用需要解决的难题之一。

摘要：目的:利用CRISPR/Cas9技术,通过多重sgRNA策略,实现在人原代T细胞中ADRB2基因的快速、高效敲除。方法:针对ADRB2基因5’端组成性外显子设计6条sgRNA,通过与pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro载体连接,构建6个单一sgRNA表达载体,分别与Cas9表达载体瞬时转染HEK-293T细胞;通过T7EN I酶切检测其介导的切割效率,筛选出4条高活性的配对sgRNA。继而将4条sgRNA有序串联克隆至pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro载体,构建成靶向ADRB2基因的多重sgRNA表达载体。瞬时转染HEK-293T细胞后,经T7EN I酶切和TA克隆测序明确其对ADRB2基因的修饰效率及方式。通过电穿孔技术将多重sgRNA质粒与Cas9质粒导入人原代T细胞。运用流式细胞术(FCM)检测该方法对靶蛋白β2肾上腺素能受体(β2 adrenergic receptor,β2-AR)的敲除效率。结果:T7EN I酶切和TA克隆测序分析的结果均表明,与单一sgRNA相比,多重sgRNA策略可获得更丰富的突变类型和更高的基因编辑效率。突变模式除了碱基的缺失、插入,还有大片段DNA缺失、倒位。随机送检的10个TA克隆全部发生了基因修饰,突变效率高达100%,且均出现了提前终止密码子。FCM检测发现,对照组中β2-AR阳性T细胞比例为43.09%,但转染多重sgRNA/Cas9后β2-AR的阳性表达率下降至25.61%。结论:本研究初步建立了在人原代T细胞中敲除β2-AR的技术方法,且该方法简便、可操作性强。本研究为进一步深入探索β2-AR在人T细胞抗肿瘤免疫中的作用奠定了技术基础。

摘要：为提高人源化的抗B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA)单链抗体(scFv)的亲和力,本研究通过计算机模拟初步探索其体外亲和力成熟的关键位点.首先利用ELISA检测噬菌体表面展示的抗BCMA的亲本单链抗体的结合活性,再通过同源模建搭建抗原-抗体复合三维结构,分析抗原-抗体间的相互作用,保留其互作界面处的关键残基,以增加其相互作用为目标而设计突变体,并利用重叠延伸PCR对scFv进行定点突变以构建突变体质粒,最后通过ELISA初步检测突变体的结合活性.结果显示:噬菌体表面展示的抗BCMA的亲本scFv具有结合抗原BCMA的活性,抗原-抗体间的非键相互作用主要为氢键和疏水相互作用,为增加抗原-抗体静电相互作用而设计了3株突变体,但根据ELISA检测结果显示静电相互作用并不是决定scFv和BCMA结合的关键因素,通过创造额外的静电作用,未能明显提高scFv的亲和力.通过计算机模拟构建了抗原-抗体复合物结构模型,确定了其亲和力成熟中应保留的关键位点,并发现静电作用并不是决定scFv与抗原亲和力的关键作用,推测氢键或其他作用力可能对亲和力的提高作用更大,为后续通过引入氢键等其他设计以提高抗体亲和力奠定了基础.