摘要：本期主要选择酶蛋白改造优化与在生物催化中的应用、微生物细胞工厂构建、底盘微生物开发和优化以及高价值生物基化学品生产等方面,特别是高效酶突变体获得、酿酒酵母合成生物学技术和包括人乳铁蛋白、α-熊果苷、橘烯、半乳糖醇在内的多种活性产物生物合成等研究论文,以及人工智能辅助酶蛋白设计和微生物形态工程等相关综述进行导读。

摘要：【目的】在大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655-ΔrecA和Escherichia coli DH10B中构建CRISPR/LshCas13a质粒干扰系统,通过靶向非必需基因lacZ和必需基因polA,分别分析RNA编辑实验中的逃逸现象。【方法】选取来自沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)中的Cas13a蛋白编码基因LshCas13a,构建可诱导的CRISPR/LshCas13a的RNA编辑系统相关质粒,选取MG1655-ΔrecA和DH10B为研究对象。通过Crisporo算法,设计靶向lacZ和polA的CRISPR RNA(crRNA)序列,考察利用LshCas13a质粒干扰实验靶向lacZ和polA的逃逸现象。再通过对逃逸菌落的数量和序列分析评估LshCas13a系统的逃逸现象,结合PCR和Sanger测序技术探究LshCas13a系统的逃逸事件。选取通过插入序列(insertion sequence,IS)转座破坏LshCas13a系统的LshCas13a基因的逃逸菌落,通过监测OD_(600)进一步考察菌株的生长情况。【结果】利用LshCas13a系统靶向MG1655-ΔrecA和DH10B中的lacZ和polA,发现靶向lacZ时,MG1655-ΔrecA通过LshCas13a基因点突变和IS转座突变方式逃逸;靶向polA时,MG1655-ΔrecA和DH10B通过点突变LshCas13a基因、IS转座和突变crRNA的直接重复(direct repeat,DR)序列等方式逃逸。LshCas13a编码基因的突变促进了菌株生长的恢复。【结论】本研究利用LshCas13a质粒干扰系统研究了***宿主RNA编辑中的多样化逃逸现象,包括了染色体编码的IS介导的LshCas13a转座突变、LshCas13a点突变、crRNA的DR序列突变或重组等情况。本研究为进一步优化CRISPR/LshCas13a基因编辑系统奠定了基础。

摘要：细菌细胞表面展示是一项重要的生物工程技术,其将外源靶标蛋白、多肽或其他生物大分子表达于细菌表面,以更好地实现其功能。该技术在生物催化、生物修复、生物传感器和疫苗设计等多个领域得到广泛应用。本文首先对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的表面展示系统进行介绍,概括了目前已知的主要宿主菌和锚定蛋白种类;然后重点阐述了细菌表面展示技术在生物修复领域的最新应用研究进展;最后总结了细菌表面展示技术在应用中存在的局限性,并展望了未来可能的发展方向,以期深入扩大和拓展该技术在生物修复实践中的具体应用。

摘要：蛋白质药物具有作用机制清晰、作用特异性强、不良反应少等优势,临床应用前景巨大。蛋白质的稳定性是蛋白质药物的一项非常重要的指标,对于其成药性、安全性和有效性都至关重要。近年来,人工智能辅助的蛋白质改造工程逐渐发展成为一种高效的蛋白质分子设计新策略,并被广泛应用于蛋白质稳定性预测、药物设计和抗体优化等方面。本文介绍主要的人工智能辅助的蛋白质稳定性优化方法,讨论不同种类优化方法的优劣及其在蛋白质药物设计和优化中的应用,探讨人工智能在蛋白质稳定性设计中的挑战和前景,以期为研究者们开发更稳定、更高效的蛋白质药物提供新的思路。

摘要：肌酐水平是指示肾脏功能的重要临床指标。肌酸酶(creatinase,CRE)是肌酐的酶促检测体系中的关键酶之一,也是整个体系的限速酶,较差的活性限制了它在临床检测和工业上的应用。针对此问题,采用半理性设计策略对产碱杆菌属(Alcaligenessp.)KS-85来源肌酸酶Al-CRE的活性进行了改造,通过对挑选出的突变热点进行饱和突变筛选和组合,最终获得多个活性提升的突变酶,活性最高的五点突变酶I304L/F395V/K351V/Y63S/Q88A比活力相较于野生型提升了2.18倍。同时对相关突变位点进行了结构分析,为肌酸酶的实际应用及对其机理的进一步解析提供了基础。

摘要：【背景】条件致病菌肺炎克雷伯菌是医源性感染最重要的革兰氏阴性菌之一,目前对该病原菌的核酸检测方法存在费时费力、灵敏度低、准确性差等问题。【目的】建立基于芯片式数字PCR的肺炎克雷伯菌检测方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的16SrRNA基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,通过与实时荧光定量PCR的比较分析,确定了芯片式数字PCR方法的检测范围和最佳反应条件,并进行了方法特异性、灵敏性分析及临床菌株的检测。【结果】芯片式数字PCR检测灵敏度比实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级,最低检出限可达到3.77 copies/μL;优化后的芯片式数字PCR特异性与实时荧光定量PCR结果一致,方法的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)均小于25%;本研究利用优化后的芯片式数字PCR方法共检测了28株临床菌株,检测到14株为肺炎克雷伯菌,14株为其他种属,这也与实时荧光定量PCR检测结果一致。【结论】采用芯片式数字PCR技术建立了肺炎克雷伯菌核酸检测的绝对定量方法。该方法特异性好、灵敏度高、准确度高,适合肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析,也为其他临床病原菌的分子检测提供了新的技术参考。

摘要：【背景】对抗生素生物合成途径的阐明有助于提高目标化合物的产量并开发具有更高活性的新化合物。基因的同框缺失是天然产物生物合成研究的常规手段,通过分析突变菌株积累的中间产物,可以帮助推导天然产物的合成途径及相关基因的功能。天然产物生物合成基因簇的大小一般在20 kb以上,对每个基因进行同框缺失耗时耗力,因此,优化链霉菌来源的基因同框缺失的方法有重要的意义。【目的】基于PCR-targeting重新设计了一套在链霉菌柯斯文库质粒上进行基因同框缺失的方法,实现链霉菌基因在大肠杆菌中快速、高效的基因同框缺失的技术体系。【方法】使用氨苄青霉素抗性基因bla作为PCR-targeting DNA片段的筛选标记,同时使用体外的Pac I酶切和酶连系统代替体内的Flp/FRT系统来介导同框缺失的构建。【结果】利用这种方法,在6 d内完成了米多霉素生物合成基因簇中14个基因的同框缺失。【结论】此方法与传统的PCR-targeting方法相比,构建同框缺失载体的效率明显提高;Pac I识别序列在链霉菌基因组上的稀有性使得此方法在构建抗生素生物合成基因簇必需基因的同框缺失载体上具有普适性。

摘要：本研究的目的是构建高效的dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖体外合成途径。参考Actinoplanes ***50/110中dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖的生物合成过程,选取了来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的D-葡萄糖-胸腺嘧啶转移酶RfbA和dTDP-D-葡萄糖-4,6-脱水酶RfbB,以及4种不同来源的氨基转移酶:来自Streptomyces venezuelae的DesI、来自大肠杆菌的GerB和WecE以及来自Shigella dysenteriae的VioA,经纯化获取了具有良好催化活性的目标蛋白。使用质谱检测各蛋白的转化效率,RfbA和RfbB的转化率分别为18.89%和98.34%;在4种氨基转移酶中VioA的反应转化率最高,可以达到41.67%。首先对RfbA催化的胸腺嘧啶转移反应进行条件优化,在最适条件下RfbA的转化率提高至32.14%。其次对VioA催化的氨基转移反应进行优化,在反应体系中加入谷氨酸脱氢酶形成催化循环,重复生成谷氨酸,推动可逆反应正向移动,转化率提高至近100%。最后扩大反应体系,得到了目标化合物dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖。本研究成功构建了高效的dTDP-4-氨基-4,6-双脱氧-D-葡萄糖体外合成途径,并且引入谷氨酸脱氢酶重复生成谷氨酸,极大地提高了可逆反应的转换效率。设计的体外多酶催化体系不仅可以用于获得阿卡波糖生物合成的关键中间体,也可用于获得具有类似生物合成过程的其他氨基双脱氧糖或糖核苷酸类化合物。

摘要：【背景】由于碳青霉烯类药物的泛用和滥用,致使肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株与日俱增,产碳青霉烯酶是肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类药物耐药的主要原因。目前对肺炎克雷伯菌碳青霉烯耐药株的检测方法存在费时费力、特异性差、灵敏度低等问题。【目的】建立一种能同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯酶基因blaKPC的双重芯片式数字PCR方法。【方法】依据肺炎克雷伯菌的特有基因yhaI和碳青霉烯耐药基因blaKPC保守序列设计特异性引物和探针,确定双重芯片式数字PCR同时对yhaI和blaKPC两个基因核酸浓度绝对定量的检测范围、检出限和最佳实验体系,并进行方法特异性、灵敏度、重复性分析及临床菌株的检测。【结果】双重芯片式数字PCR检测灵敏度比双重实时荧光定量PCR提高了约1.5个数量级,在两基因同时检出的情况下,最低检出限分别为3.74 copies/μL (yhaI基因)和1.93 copies/μL (blaKPC基因);优化后的双重芯片式数字PCR对参考菌株检测特异性的结果与双重实时荧光定量PCR结果一致;利用优化后的双重芯片式数字PCR方法共检测58株临床菌株,其中肺炎克雷伯菌43株,属肺炎克雷伯菌且含有blaKPC基因的菌株13株,这与质谱及耐药谱检测结果一致。【结论】利用双重芯片式数字PCR技术建立了产KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌的绝对定量检测方法。该方法特异性强、灵敏度高、准确度好,可用于检测具有碳青霉烯酶基因blaKPC的肺炎克雷伯菌的核酸检测和定量分析,也为产其他类型碳青霉烯酶的病原菌检测提供了新的技术参考。

摘要：【背景】DNA组装技术是基因组合成中的一个关键技术。探索低成本、高效率的基因组合成技术一直是合成生物学的重要研究领域。在某些细菌如变铅青链霉菌中,DNA上有磷硫酰化修饰(简称硫修饰),而在另一些细菌如天蓝色链霉菌中存在一种含有硫修饰识别结构域(sulfur-binding domain,SBD)的识别蛋白,可以特异性识别DNA上的硫修饰,这启发了我们发展出一种新的DNA组装技术。【目的】探究在DNA末端硫修饰的连接中,T4 DNA连接酶与SBD相融合蛋白和单独的T4 DNA连接酶相比,是否有更高的连接效率。【方法】根据同源重组原理,设计硫修饰引物,扩增硫修饰的DNA片段。构建T4 DNA连接酶与SBD融合蛋白的3种表达载体T4-linker-SBD(Hga)、T4-linker-SBD(Spr)和T4-linker-SBD(Mmo),表达纯化以上3种融合蛋白。比较3组浓度梯度(2.4、0.24、0.024 mg/mL)T4 DNA连接酶与融合蛋白在2.5 kb和8.0 kb DNA片段连接上的差异。【结果】DNA末端硫修饰的2.5kb和8.0kb的两端片段均能扩增,而且3种融合蛋白均能表达。在两段2.5 kb片段的体外连接实验中,每组T4 DNA连接酶与融合蛋白均能连接成5 kb片段;然而在两段8.0 kb片段的体外连接实验中,相同连接时间和相同酶浓度下,仅融合蛋白T4-linker-SBD(Hga)能够将8.0 kb片段连接成16 kb的长片段。【结论】根据两组琼脂糖凝胶电泳的实验结果可知,在两段8.0 kb的DNA长片段连接实验中,T4-linker-SBD(Hga)融合蛋白具有更高的连接效率。本研究方法以较低的成本和比较高的效率为大片段DNA组装提供了一种新的方法和思路。