摘要：果蝇基因srp是血液发育的早期标记基因,为了研究果蝇这一模式动物中血液发育的详尽过程,通过提取野生型成体果蝇的总RNA,反转录获得其cDNA文库,设计引物克隆出srp基因,将所得片段插入原核表达载体pET28a中,经酶切和序列鉴定,成功构建重组质粒,并通过IPTG诱导表达出His-srp融合蛋白,经Ni-IDA凝胶柱纯化后,免疫新西兰大白兔制备srp多克隆抗体,为血液发育研究奠定了基础.

摘要：为研究fhl1a基因在心脏发育中的作用,利用CRISPR/Cas9系统敲除斑马鱼fhl1a基因.在斑马鱼fhl1a基因的三号外显子处选取打靶位点,构建sgRNA表达载体.将体外转录的sgRNA和Cas9 mRNA混合物分别显微注射到斑马鱼单细胞期的受精卵中以期实现对目的靶基因fhl1a的敲除.随后收集部分72 h胚胎进行PCR检测和产物直接测序,确定有无突变.为进一步验证突变是否可稳定遗传,选择具有敲除了的F_0与野生型斑马鱼进行外交,对获得的F_1进行逐一剪尾,提取DNA进行PCR和测序分析.结果显示F_1获得了不同程度的插入、缺失等突变类型.研究结果证明所设计的fhl1a基因CRISPR/Cas9敲除系统能在斑马鱼体内有效地形成基因突变,该突变能稳定地遗传到下一代个体,这为进一步研究fhl1a基因在心脏发育中的具体调控机制打下了基础.

摘要：为构建一个针对TCF25(transcription factor 25)基因的慢病毒干扰载体,设计并合成3组针对TCF25的短发夹RNA序列(shRNA),通过基因重组技术连入p LL3.7载体,酶切鉴定及DNA测序后,重组正确的p LL3.7质粒与病毒包装质粒共转染293FT细胞,培养48 h后,分别收集细胞培养上清液,感染H9C2细胞,Western-blot检测TCF25在H9C2细胞中的表达.结果显示TCF25蛋白在H9C2细胞中的表达被抑制.这说明TCF25的慢病毒干扰载体构建成功.

摘要：心肌肥大(cardiac hypertrophy)是由外周组织对血流动力学需求增加而发生的一种代偿性反应。在心肌肥大过程中,不同时期的不同类型的基因表达受到生理和病理信号的多级转录调控。组蛋白乙酰化作为最广泛的翻译后修饰方式,受相互拮抗的组蛋白乙酰化酶(histone acetyltransferases,HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases,HDACs)的精细控制。近年来研究表明,HDACs作为一类抑制转录过程并含有高度保守的脱乙酰酶结构域家族酶,通过多种作用途径调控心肌肥大过程中的基因表达。本文主要综述了组蛋白去乙酰化酶调节心肌肥大过程的相关研究进展,通过阐明不同种类HDACs在心肌肥大中的作用和分子机制,为不同类型心肌肥大和心衰的发病治疗提供新的思路,为新药设计提供分子靶点。

摘要：WBP11是WW结构域结合蛋白家族的一员,参与前体mRNA剪接过程,是重要的剪接因子。斑马鱼作为重要的模式生物之一,其基因组中含有人类WBP11的同源基因wbp11。为了研究WBP11在脊椎动物早期发育过程中的作用机制,利用CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼wbp11基因敲除品系。首先,在wbp11基因的第二个外显子上设计基因敲除靶位点,体外转录合成sgRNA,通过显微注射技术对斑马鱼进行基因敲除,得到F0代嵌合体斑马鱼。随后,将嵌合体斑马鱼与野生型斑马鱼杂交,所得到的F1代斑马鱼进行基因型鉴定,筛选出其中的杂合子斑马鱼,并对杂合子斑马鱼的缺失条带进行测序,结果显示其为wbp11基因的2种缺失突变。让同种突变的F1代杂合子斑马鱼自交,对得到的后代F2进行基因型鉴定,筛选获得了纯合子斑马鱼,表明wbp11基因敲除品系构建成功。经显微镜白光成像观察发现,受精后48 h的斑马鱼出现心包水肿、心脏线性化、骨骼弯曲畸形,这可能是由于wbp11基因突变引起剪接机制异常所导致的。此研究为探究WBP11基因在脊椎动物的早期发育中的作用机制开辟了道路。

摘要：目的风疹病毒(Rubella virus,RV)是先天性风疹综合征(先天性心脏病、先天性白内障和耳聋的三联综合征)的致病因素,本研究针对RV全基因组序列的生物信息学特点,设计RV 60-m er长链寡核苷酸探针,探讨寡核苷酸探针和功能基因芯片的设计方法。方法利用生物信息学软件Array Designer 2.0针对RV全基因组设计Tm值相近、长度均一的60-m er探针,利用其BLAST功能将所得探针在GenBank数据库进行序列比对分析,筛选得到RV特异性O ligo探针并设计成功能基因芯片。结果获得11条60-m er O ligo探针,用于打印成DNA芯片,拟用于RV检测与病毒基因表达功能分析。结论利用Array Designer 2.0软件设计芯片探针比常见其他方法更有效,尤其适合于病毒检测和病毒基因功能分析复合型芯片的设计。

摘要：为了探究蛋白激酶D(protein kinase D,PKD;又名PRKD)家族典型成员prkd1基因对早期心脏发育的影响,选用模式动物斑马鱼为研究对象,设计了吗啉代反义寡核苷酸敲低实验。表型观察结果显示,prkd1基因敲低会导致斑马鱼心脏发育异常,出现心包水肿、环化异常、心管线性化等畸形表型;斑马鱼心率分析数据显示,与野生型斑马鱼相比,prkd1基因的敲低会导致早期斑马鱼心率降低。利用转录组高通量测序技术对受精后3 d(3 days post fertilization,3 dpf)的斑马鱼对照组和敲低prkd1组进行测序,差异基因富集分析表明,prkd1的敲低与心脏相关信号通路如心肌细胞的肾上腺素信号通路等显著相关。进一步通过qRT-PCR对高通量测序结果进行验证,并对早期心脏发育关键因子进行检测,结果显示,部分心血管相关基因显著下调,tbx5a、gata4等心脏调控关键基因同样显著下调。这些表明prkd1基因可能通过调控心脏发育相关信号通路以及心脏发育关键基因来影响早期心脏发育,在早期心脏发育过程中发挥重要作用。

摘要：研究工作者们一直致力于寻找一种在模式生物中进行精确基因修饰的方法。近期基于TALENs的基因打靶方法受到广泛的注意,并在包括果蝇、斑马鱼、小鼠及人类多潜能细胞的多物种中取得成功。在这里,我主要介绍基于TALENs的基因修饰在果蝇模型中的应用以及果蝇心脏发育候选基因Yippee的敲除。首先,我们设计并拼接好了Yippee基因的TALENs靶位点序列,连接在核酸酶Xmn I的催化区域。在核酸酶的作用下产生双链的断裂,随后在非同源末端连接物修复系统(NHEJ)的修复下导致Yippee基因的消除或部分缺失。经过检测,得到Yippee基因的TALENs打靶效率约为9%。

摘要：已有研究表明RMND5B可能与心肌肥大相关,但具体机制不明,RMND5B的重组腺病毒载体的构建和鉴定为研究RMND5B功能提供了基础工具。首先,设计小鼠RMND5B基因的特异性引物,以c DNA为模板,PCR扩增RMND5B ORF区,并在两端各加入HindⅢ及SalⅠ的酶切位点。将此片段插入到p MD18-T载体,再亚克隆至线性化的穿梭质粒p Ad Track-CMV中。PmeⅠ酶切线性化之后,电转化到含p Ad Easy-1的BJ5183感受态细菌中。在BJ5183细菌中发生同源重组获得了重组质粒p Ad-RMND5B质粒。PacⅠ酶切线性化之后转染293A细胞,经过包装获得腺病毒AdRMND5B。将此腺病毒感染新生大鼠原代心肌细胞,并在一段时间后观察绿色荧光并通过RT-PCR检测RMND5B的表达情况。结果表明,成功构建了RMND5B的重组腺病毒载体并实现了AdRMND5B在新生大鼠原代心肌细胞中表达,为进一步研究RMND5B基因在心肌肥大中的作用奠定了良好的实验基础。

摘要：Kruppel在果蝇发育过程中起着重要的调控作用。为了进一步研究Kruppel的功能,需要制备Kruppel蛋白及其抗体.对已有的Kruppel序列进行分析,选取适当区域进行引物设计,从果蝇心脏cDNA文库中PCR扩增得到Kruppel部分编码区序列,并其连接到pET-28a载体上。将重组质粒(pET-28a-Kruppel)转化rosetta受体菌,通过IPTG(Isopropylβ-D-thiogalactoside)诱导表达融合蛋白,用镍柱进行亲和纯化。将纯化得到的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体的效价。