摘要：以4种鸡球虫实验室保存株(毒害、巨型、柔嫩、堆型艾美耳球虫)的基因组DNA为模板,分别用针对4种球虫的ITS-1序列设计的种特异性引物进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,观察特异性条带。结果显示,只有在模板和扩增引物为同一种球虫时,方能扩增出特异性条带。表明本实验室保存的4种鸡球虫均为纯种株,建立的PCR检测方法可以用于鸡球虫纯种的鉴定。

摘要：为探讨猪氨肽酶N(APN)作为产肠毒素性大肠杆菌F4ac的受体蛋白的可能性,根据GenBank上的猪APN mRNA序列设计合成特异性引物,从新鲜的猪小肠组织中提取总RNA并反转录成cDNA第一链,RT-PCR扩增猪APN全长基因,并分别构建真核表达和原核表达系统。结果表明:APN基因已正确插入pcDNA3.1真核表达载体和pET-28a(+)原核表达载体,SDS-PAGE结果证明重组蛋白为包涵体,且纯化产物在110ku处有单一明显条带。pcDNA3.1-APN和pET28a-TAPN双系统的成功构建以及APN蛋白的成功表达,为进一步研究和验证该蛋白作为猪F4ac受体候选蛋白的可能性奠定基础。

摘要：为了敲除山羊乳中致敏源β-乳球蛋白(BLG)基因,同时在BLG基因座定点整合人乳铁蛋白(hLF)基因。首先针对山羊BLG第3外显子识别位点设计了1对特异性TALEN-3-L/R质粒对;同时,构建了含有1个HSV-TK负筛选基因的hLF基因打靶载体BLC14-TK。TALENs质粒对转染山羊胎儿成纤维细胞,2μg/m L嘌呤霉素筛选3 d,PCR扩增产物测序来验证其切割DNA活性。打靶载体BLC14-TK与TALEN-3-L/R质粒对共转染山羊胎儿成纤维细胞,经700μg/m L G418和2μg/m L GCV共筛选药物抗性细胞株;通过整合检测和同源重组检测来筛选hLF基因打靶细胞株;BLG~–/hLF^+打靶细胞株作为供核细胞进行山羊体细胞核移植。结果为:TALEN-3-L/R致突变率为25%-30%;获得BLG~–/hLF^+打靶细胞6株;共制作重构胚胎335枚,移植受体山羊23只,B超检测到30-35 d的妊娠受体9只(妊娠率39.1%),其中1只50日龄克隆胎儿验证为BLG~–/hLF^+基因型。以上结果表明获得BLG基因座定点整合hLF基因的基因打靶山羊是可行的,为培育羊乳中含低致敏原和富含hLF的山羊新品系奠定了基础。

摘要：为了对1株番鸭细小病毒(MDPV)分离株NY18株的分子特征予以准确揭示,通过设计重叠PCR引物,扩增NY18株的完整基因组并进行了测序。结果显示,NY18株基因组由5071个碱基组成,5′和3′端末端倒置重复序列(inverted terminal repeats,ITR)均由424个碱基组成,其外侧385个碱基形成回文发夹结构。Simplot 3.5.1和RDP4软件分析表明,NY18株经历了2次重组事件,第1次重组产生在VP3基因的1.1 kb区域,第2次重组事件产生在P9启动子至Rep基因上游约100 bp区域内。2次重组均以经典型MDPV YY株作为主要亲本,而经典型鹅细小病毒(GPV)强毒株DY16和鹅胚化的弱毒疫苗株SYG61v作为次要亲本参与了重组。NY18株的ITR与经典型MDPV FM和YY株的同源性为97.9%和99.1%,而与GPV强毒株YZ99-6的同源性仅有86.0%,表明NY18株ITR仍来自于经典型MDPV。以VP1基因1.1 kb重组区片段构建遗传进化树,NY18株与经典型GPV处于同一分支,而以非重组区的Rep1基因1774 bp和VP1基因氨基端694 bp、羧基端405 bp片段分别构建遗传进化树,NY18株则与经典型MDPV处于同一分支。结果表明,NY18株既不同于经典型MDPV也不同于GPV,其本质是1株重组型的MDPV。

摘要：肌型磷酸果糖激酶(PFKM)是作用于果糖-6-磷酸生成果糖-1,6-双磷酸的关键调节酶,在机体葡萄糖代谢、肌肉发育等多个生物过程中起关键作用。根据猪PFKM序列结构特点设计sgRNA序列并构建CRISPR/Cas9基因敲除质粒。敲除质粒转染猪PK15细胞并经嘌呤霉素筛选,极限稀释法筛选出单细胞克隆,提取各个细胞克隆DNA,利用PCR扩增敲除区域序列,通过序列测定确定是否敲除成功,利用实时荧光定量PCR及Western blot分别检测PFKM mRNA及蛋白质表达水平。结果表明:转染CRISPR/Cas9基因敲除质粒筛选到的单细胞克隆中,有2株细胞PFKM基因序列发生基因突变,其中1个克隆为碱基插入,另1个为碱基插入、替换及缺失;qRT-PCR定量检测结果表明,筛选到1株细胞PFKM mRNA表达量下降89.41%,差异极显著。Western blot检测结果表明,与正常细胞组相比,2组敲除细胞株中PFKM蛋白表达量分别下降78.77%、81.63%,差异显著。这一研究显示利用CRISPR/Cas9系统成功获得了2株PFKM基因敲除细胞株,为后续研究PFKM基因在猪肌肉发育、能量代谢及线粒体功能等方面的作用奠定了基础。

摘要：为了构建猪PPARD基因编辑载体并进行基因编辑效率检测,本研究利用改良的双位点编辑CRISPR/Cas9载体系统,根据PPARD基因结构和序列特点,设计2个能靶向切割PPARD基因的sgRNA序列,将2个PPARD sgRNA表达盒以串联的形式连接到一个CRISPR/Cas9载体中。将构建的质粒转染PK15细胞,提取各组细胞DNA,PCR扩增突变区域后,通过序列测定在DNA水平检测载体编辑效率。分别提取各组细胞总RNA及细胞总蛋白,利用qRT-PCR及Western blot在基因表达及蛋白表达水平上检测重组载体的基因编辑效率。结果发现,PPARD-2KO组DNA总突变率为45.83%(22/48);与正常对照组相比,PPARD基因编辑组中PPARD mRNA显著下降84%(P<0.01),PPARD蛋白表达量显著下降61%(P<0.01)。本研究利用改良的CRISPR/Cas9载体系统成功构建了高效PPARD基因编辑载体,并且未经药物筛选即可在细胞上实现高效率基因编辑,将大幅提高后续筛选单细胞克隆效率,推进对PPARD基因的功能研究。

摘要：8只健康比格犬采用随机交叉试验设计,盐酸特比萘芬注射液按5 mg/kg单剂量静注,盐酸特比萘芬片按20mg/kg单剂量口服给药,洗脱期为2周。采用高效液相色谱法测定犬血浆中特比萘芬的浓度,以药动学分析软件WinNonlin5.2的非房室模型分析方法处理血药浓度-时间数据。结果显示,犬静注盐酸特比萘芬注射液的药动学参数分别为:Tmax(0.083±0.000)h,Cmax(3.334±0.185)mg/L,T1/2β(15.158±8.558)h,MRT(2.443±1.132)h,AUClast(1.803±0.374)h·mg/L,Vd(49 778.164±25 594.370)mL/kg,CLB(2 414.907±577.369)kg·mL/h。犬口服盐酸特比萘芬片的主要药动学参数为:Tmax(1.875±0.791)h,Cmax(0.324±0.126)mg/L,T1/2β(18.150±10.557)h,MRT(5.019±1.591)h,AUClast(1.094±0.588)h·mg/L,Vd(395 321.202±236 694.989)mL/kg,CLB(14 340.535±3 560.508)kg·mL/h,Flast(16.589±11.495)%,F0~∞(18.236±8.114)%。结果表明,特比萘芬片剂在犬体内吸收迅速,保留时间更长,消除更为缓慢,有长效抑菌效果。

摘要：针对小鼠ERO1α基因构建短发卡RNA(Short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体。根据NCBI中小鼠ERO1α基因序列,设计3条针对ERO1α的shRNA序列和1条阴性对照shRNA序列。将shRNA序列连接到慢病毒载体pCD513B-U6上,同时进行PCR鉴定及测序,分别命名为pCD513B-ERO1α-shRNA和pCD513B-NC-shRNA。将构建好的重组质粒和包装辅助质粒共转染HEK 293T细胞,包装产生慢病毒。将所得病毒悬液进行浓缩,同时梯度稀释转导HEK 293T细胞,检测病毒滴度。浓缩后的慢病毒转导RAW 264.7细胞,通过RT-qPCR和Western blot技术进行有效片段的筛选。之后,将筛选的慢病毒转到多种细胞系或者原代细胞,用RT-qPCR和Western blot技术检测ERO1α基因的表达情况。PCR及测序结果表明,重组慢病毒干扰载体pCD513B-ERO1α-shRNA构建成功,所包装的慢病毒其病毒滴度为5×10^7 TU/mL^10×10^7 TU/mL。RT-qPCR和Western blot结果表明,pCD513B-ERO1α-shRNA-3抑制ERO1α表达的效果最好,干扰效率在80%左右。pCD513B-ERO1α-shRNA-3能够转导多种细胞,并显著抑制ERO1α的表达,干扰效率在70%~90%。成功构建针对小鼠ERO1α基因的shRNA重组慢病毒载体,为进一步研究ERO1α功能奠定了技术基础。

摘要：动物生物安全三级实验室(ABSL-3)作为国家新发再发传染病的生物安全体系基础支撑平台,为研究高致病性病原微生物的生物学特性、预防和治疗手段提供了至关重要的硬件基础。ABSL-3实验室也为高校“产学研”结合提供了重要支撑。ABSL-3实验室正常运行和科研工作顺利开展,离不开应急预案工作的精心策划和有效实施。此外,实验室合理的设计和布局也是规避和降低意外事故的关键因素。本文结合扬州大学ABSL-3建设管理实践,从应急预案准备工作入手对实验室建设布局、日常运行及污水处理、终末消毒具体措施和突发事件处置等方面的注意事项展开介绍,以期为今后操作各种病原微生物的生物安全实验室提供有益的参考。

摘要：为研究国产和进口托芬那酸注射液在犬体内的药代动力学和生物等效性,采用双处理、双周期随机交叉试验设计,将20头健康比格犬随机分成2组,按0.1 m L/kg体重肌肉分别单剂量注射受试制剂和参比制剂,采用高效液相色谱法测定血浆中托芬那酸的浓度,利用WinNonlin6.3软件计算主要药动学参数,并评价两种制剂的生物等效性。结果显示,受试制剂和参比制剂的Tmax分别为(0.2±0.1)h和(0.3±0.2)h;Cmax分别为(5.12±1.55)μg/m L和(5.38±2.04)μg/m L;AUC0-t分别为(12.1±2.97)μg·h·m L^(-1)和(12.28±3.24)μg·h·m L^(-1);AUC_(0-∞)分别为(13.38±3.10)μg·h·m L^(-1)和(13.85±3.40)μg·h·m L^(-1)。托芬那酸注射液受试制剂和参比制剂的AUC_(0-t)、AUC_(0-∞)、C_(max)、T_(max)均无显著性差异(P>0.05)。双单侧t检验结果显示两种制剂生物等效,临床上可相互替代。该试验为兽医临床给药方案的制定以及合理用药提供参考。