摘要：为确定徐淮山羊Oct4(Octamer-binding transcription factor 4)基因启动子活性区域,并初步探讨TSA(Trichostatin A)和VPA(Valproic acid)对Oct4基因启动子活性的调控作用,文章采用Primer5.0设计包含Oct4基因启动子不同长度片段的特异性PCR引物,扩增并定向克隆至PGL3-Bacic荧光素酶报告载体,分别转染gEF、P19和COS7细胞,通过TSA和VPA诱导,进行双荧光报告基因活性检测。同时用Oct4启动子–1516^+30 bp片段替换pEGFP-N1中的CMV启动子,通过GFP荧光表达检测Oct4启动子的活性。结果表明:在gEF、P19和COS7细胞中Oct4启动子各片段均表现出不同程度的活性,且最强活性区域为上游–1516^+30 bp,基本活性区域为–238^+30 bp;在–1516~–946 bp、–615~–96 bp区域存在正调控元件,在–1936~–1516 bp、–946~–615 bp区域存在负调控元件;终浓度为1μmol/L的TSA和4 mmol/L的VPA为诱导的最佳浓度,均能显著增强Oct4基因启动子的活性;–1516^+30 bp片段能够启动GFP的表达。研究结果为揭示Oct4基因的转录调控机制奠定了基础。

摘要：为探究睾丸注射法制备转基因动物的可能性,文章将携带有山羊心脏型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)和绿色荧光蛋白标签的重组载体经脂质体包裹后随机打点注射小鼠睾丸。对实验小鼠进行睾丸切片、精子荧光检测以及精子DNA检测,证实外源基因在亲代小鼠体内成功表达。睾丸注射后小鼠与正常母鼠交配产生的F1代,以及F1代自交产生的F2代在不同水平均可检测到外源基因的成功表达,阳性率分别为4%和30.23%。研究结果说明睾丸注射是一种制备转基因动物行之有效的方法,且外源基因可以稳定遗传。该方法的完善和成熟对于动物转基因以及动物性状改良和育种具有理论和实践意义。

摘要：旨在探讨BMP4诱导鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化的作用机理。采用单层贴壁培养作为分化模式，分别采用10、20、30和40ng·mL-1 BMP4浓度诱导雄性鸡胚胎干细胞，通过形态学、荧光定量PCR和免疫细胞化学检测诱导效果。根据细胞形态变化和差异基因表达量变化，确定了BMP4的适宜诱导浓度为40ng·mL-1。在适宜浓度诱导过程中，诱导4d类胚体开始出现，6～8d类胚体逐渐增大，数量增多，10d部分类胚体开始散开，变为小的圆形细胞，12d在散开后的类胚体周围可观察到少量生殖样细胞，14d生殖样细胞数目增多，且呈聚团生长的趋势。诱导过程中相应基因表达量也发生变化：胚胎干细胞标记基因Nanog、Sox2表达量显著下降（P〈O．01），生殖细胞特异基因Stra8、Dazl、integrina6、c-kit表达量均呈显著上升趋势（P〈O．01）。BMP4可以引起生殖细胞相应基因的表达，促进雄性鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞方向分化，结果为雄性生殖细胞的体外诱导研究提供试验参考，为进一步研究雄性生殖细胞发生和调控机制提供理论基础。

摘要：本研究旨在确定徐淮山羊c-Myc基因启动子区域,找出该基因启动子的核心调控区,初步探讨c-Myc基因的表达调控机制。根据UCSC基因组数据库已公布的绵羊c-Myc基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增c-Myc基因的一系列启动子缺失片段,定向克隆至pEGFP-N1和PGL3-c-Myc,分别转染gFF、COS7及P19细胞,并进行TSA和NFAT1诱导,同时对-402^-249bp区域的转录因子SP1结合位点进行定点突变,最后进行双荧光报告基因活性检测。结果表明,徐淮山羊c-Myc基因5′侧翼区-1 334^+1bp区域的启动子活性最强,-402^+1bp区域为c-Myc基因启动子基本活性区域。进一步研究发现,-1 334^-971bp、-587^-147bp区域存在正调控元件,-1 976^-1 334bp、-971^-587bp区域存在负调控元件。TSA和NFAT1均能增强cMyc启动子的活性,SP1结合位点定点突变后,启动子活性降低。本试验通过构建包含c-Myc基因启动子不同片段的重组报告基因载体并比较其转录活性,确定了c-Myc基因启动子的核心区域,发现转录因子SP1是c-Myc基因启动子核心区域的调控元件,为进一步研究c-Myc基因的表达调控机制奠定了基础。

摘要：采用酶消化法分离鸡胚原始生殖细胞(PGCs),纯化后进行体外培养,传至5～6代时,通过对阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)免疫荧光标记、碱性磷酸酶检测等方法联合鉴定其基本生物学特性,同时以RT-PCR方法检测其特异基因的表达。结果表明:体外培养的PGCs维持未分化状态,碱性磷酸酶阳性、免疫荧光检测其特异标志物SSEA-1阳性。鸡胚PGCs表达减数分裂前标志基因Dazl、Nanog和GDF3,生殖细胞分化后期基因CVH,原始生殖细胞标志基因Blimp-1以及干细胞多能性相关基因Oct-4,不表达减数分裂启动基因Stra8。提示所获得的鸡胚PGCs,其生物学特性稳定,表达相关特异基因,为鸡胚PGCs的体外培养及鉴定提供理论依据。

摘要：选取我国地方品种福建黄兔为研究对象,利用冰冻切片技术对不同发育阶段福建黄兔背肌和腿肌的肌纤维性状进行研究,通过荧光定量聚合酶链式反应技术分析在肌肉发育过程中起重要作用的Myh6基因在福建黄兔不同发育阶段表达水平的差异,并与肌纤维性状进行相关性分析。结果显示:2、4、6、8、10和12周龄福建黄兔的白肌纤维密度均显著大于红肌纤维和中间型肌纤维,白肌纤维的面积显著高于红肌纤维,长径和短径的大小排列为白肌纤维>中间型肌纤维>红肌纤维,但差异无统计学意义;在6周龄前,背肌和腿肌中各类肌纤维长径、短径和面积呈显著增大的趋势,而6周龄后增大趋势逐渐变缓;Myh6基因在公母兔背部和腿部的表达均呈先上升后下降的趋势,其中母兔在4周龄表达量最高,公兔在6周龄表达量最高;Myh6基因的表达量与肌纤维面积、长径和短径的变化一致。表明Myh6基因与肌纤维类型和肌纤维的生长发育密切相关。

摘要：旨在克隆如皋黄鸡Nanog基因启动子,并构建含有双荧光素酶报告基因的表达载体进行启动子活性分析,找出该基因启动子的核心调控区;探索甲基化抑制剂5-Azadc(5-Aza-2′-deoxycytidine)或曲古抑菌素(Trichostatin A,TSA)对Nanog基因启动活性及其ESC体外培养条件下多能性维持的影响,为初步阐明Nanog基因的表达调控机制提供理论依据。PCR扩增Nanog基因不同长度片段的启动子序列,定向克隆至pGL3-basic载体和pEGFP-N1构建重组载体;将重组载体转染DF-1细胞后,48h收集蛋白,采用双荧光素酶报告基因检测系统测定其转录活性,确定基本转录调控区;将重组载体转染DF-1细胞后添加5-Azadc或TSA对Nanog基因进行诱导表达,并通过双荧光素酶报告基因检测系统,分析其对Nanog基因启动子活性的影响。选取生长至第3代的ESC,培养基中添加最适浓度的5-Azadc和TSA,每隔两天观察细胞,分析其对ESC体外多能性维持的影响,并对诱导至第10天的细胞进行间接免疫荧光检测。结果表明,成功构建3个片段的双荧光素酶报告基因表达载体;双荧光素酶活性检测结果显示,pGL3/1967活性最强;分别添加或者联合添加5-Azadc和TSA均可使Nanog基因的转录活性增强;5-Azadc和TSA诱导对ESC体外培养条件下多能性维持的影响结果显示,诱导6d后,对照组细胞大量分化,细胞克隆无法维持,而5-Azadc和TSA诱导组克隆明显,5-Azadc+TSA联合诱导组细胞克隆数量显著多于对照组;诱导至第10天,对照组细胞完全分化,没有细胞克隆,而诱导组存在大量细胞克隆,联合诱导组克隆数量显著多于其他两组;SSEA-1间接免疫荧光结果显示,对照组没有明显的ESC克隆,而5-Azadc组和联合诱导组细胞克隆明显,综上表明,5-Azadc和TSA可有效地通过提高Nanog基因的表达而维持鸡ESC在体外培养过程中的多能性。

摘要：【目的】分析Myh6基因在新西兰白兔Oryctolagus cuniculus肌肉中的表达规律及与肌纤维特性的相关性,探究Myh6基因在肌纤维发育过程中的作用。【方法】利用冰冻切片技术测量了2、4、6、8、10、12周龄新西兰白兔背腿肌中不同类型肌纤维的密度、面积、长径和短径等性状,采用qRT-PCR测量了Myh6基因在不同周龄新西兰白兔背腿肌中的表达量,分析了上述性状与Myh6基因表达的相关性。【结果】2~8周龄新西兰白兔各类型肌纤维的密度逐渐变小,面积、长径和短径则逐渐变大(白肌纤维短径除外,仅在2~6周龄有变大趋势)。Myh6基因在4周龄表达量最高。Myh6基因表达量与公兔背部红肌纤维的面积呈极显著负相关(P<0.01),与公兔腿部红肌纤维的密度呈极显著正相关(P<0.01)。【结论】Myh6基因表达与肌纤维类型和肌纤维的生长发育密切相关。

摘要：研究旨在探讨促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 1,MAP3K1)基因对体外培养长江三角洲白山羊毛囊干细胞(HFSCs)增殖和凋亡的影响。针对MAP3K1基因设计3个干扰靶点,构建pDNA316-ZsGreen-ShRNA腺病毒干扰载体。转染HFSCs,以空载体细胞为对照,RT-qPCR技术检测干扰MAP3K1效果及增殖相关基因(PCNA、CDK1、CCND2)、凋亡相关基因(Bax、Bcl-2)表达水平,CCK-8和EdU法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡。结果表明,shRNA(MAP3K1-sh)转染HFSCs后,MAP3K1基因相当表达量极显著下降(P<0.01);增殖相关基因mRNA表达水平显著下降,促凋亡基因Bax的mRNA表达水平显著提高,相反,抗凋亡基因Bcl-2的mRNA表达显著降低;CCK-8和EdU结果发现细胞增殖受抑制,S期细胞数量显著上升;细胞总凋亡量显著上升。综上,干扰MAP3K1基因表达显著抑制HFSCs增殖并促进其凋亡,研究为阐明调控长江三角洲白山羊优质笔料毛分子形成机制提供科学参考。

摘要：白细胞介素-10(IL-10)是一种多功能的细胞因子,参与免疫调节和抗炎反应。本研究旨在克隆并表达IL-10基因,以制备兔IL-10多克隆抗体。运用RT-PCR技术从新西兰白兔脾脏总RNA中扩增IL-10基因,将该基因亚克隆入原核表达载体pET-32a并转入大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达获得融合蛋白,融合蛋白经纯化后免疫豚鼠制备多克隆抗体,最后分别用间接ELISA和Western blot检测抗体的效价和特异性。结果表明:克隆得到了兔IL-10基因,大小为537bp,经核苷酸测序与GenBank已登录的基因序列(NM_001082045)相似性为99%;重组载体pET-IL-10构建成功;SDS-PAGE电泳结果显示融合蛋白成功表达;制备的多克隆抗体效价高达1∶56 000,且具有很高的特异性。成功实现了兔IL-10基因的原核表达,并制备了豚鼠抗兔IL-10多克隆抗体,为深入研究兔IL-10基因的功能奠定了基础。