摘要：研究旨在探究差异代谢物泛酸(PA)对鸡胚胎干细胞(ESCs)向原始生殖细胞(PGCs)分化过程中的作用,为从代谢角度解析PGCs形成机制提供新的理论基础。试验基于转录组学筛选出PA,通过CCK8与EdU试验探究PA及其代谢抑制剂PZ的适宜添加浓度;最后,分别通过观察细胞形态、qRT-PCR检测PGCs特异标记基因、间接免疫荧光和流式细胞分析等分析PA代谢在ESCs向PGCs分化过程中的作用。结果显示:参与PA代谢相关的基因在ESCs与PGCs中呈现差异性表达,且富集于生殖细胞分化相关的通路(Pantothenate and CoA biosynthesis、TGF-beta signaling pathway和AMPK signaling pathway);PA和PZ的适宜添加浓度分别为20μmol/L和80 nmol/L;PA组在第6天的类胚体数目显著低于PZ组,PA组中CVH和C-KIT3的表达量显著低于PZ组(P<0.01);PA组的DDX4阳性细胞数显著低于PZ组(P<0.01)。结果表明添加PA抑制PGCs的形成,添加PZ促进PGCs的形成。

摘要：为克隆如皋黄鸡Stra8基因的3’UTR,寻找靶向Stra8基因的microRNA(miRNA),以鸡精原干细胞的c DNA为模板,根据NCBI数据库Stra8的CDS序列设计引物,通过3’RACE技术克隆Stra8基因的3’UTR,并构建相应的荧光素酶表达载体和突变载体;利用生物学预测软件对靶向Stra8 3’UTR的miRNA进行预测,选择评分最高的miRNA进行慢病毒载体构建;以pRL-TK为内参,分别将miRNA与Stra8 3’UTR荧光素酶表达载体和突变载体共转染DF-1细胞,利用双荧光素酶基因报告系统对miRNA进行活性检测。结果表明,采用3’RACE技术成功克隆Stra8基因的3’UTR;Targetscan生物在线软件预测到靶向Stra8基因的4个特异性较高的miRNA,并成功构建其相应的慢病毒载体;双荧光素酶活性检测结果显示,gga-miR-1a、gga-miR-31、ggamiR-218均可通过3’UTR序列抑制Stra8基因的表达,其中gga-miR-31抑制效果最佳。该结果可为后续深入探讨gga-miR-31介导调控的Stra8基因在雄性生殖细胞分化中的调控网络提供依据。

摘要：为确定鸡gga-miR-31-5p启动子基本活性区域,并分析调控其转录的重要转录因子,初步探究影响鸡gga-miR-31-5p的表达调控机制,采用PCR法扩增鸡gga-miR-31-5p启动子,插入到pEGFP-N1载体,构建重组载体。利用菌液PCR及测序鉴定阳性重组质粒。将重组载体转染DF-1细胞系,观察其启动活性。利用在线预测网站预测gga-miR-31-5p启动子区域的转录因子结合位点。结果显示,成功克隆出gga-miR-31-5p启动子片段,并成功构建其pEGFP重组载体。体外转染结果表明,该区域具有启动活性,并发现鸡gga-miR-31-5p启动子区域存在RARα、ER、c-Jun、GR等重要转录因子结合位点。研究初步确定了鸡gga-miR-31-5p启动子区域,同时发现该区域存在重要转录因子结合位点,该结果为后续探讨进一步研究gga-miR-31-5p启动子的生物学功能奠定基础。

摘要：近年来,随着人们对CRISPR-Cas系统研究的不断深入和改造,CRISPR-Cas系统已成为一项新的基因靶向修饰技术,能够定向对靶基因进行定向沉默,目前该项技术已经成功地用于HEK293、小鼠及斑马鱼的细胞并产生了稳定的基因敲除细胞株,在小鼠、果蝇等模式动物上成功构建了基因敲除模型。CRISPR-Cas以其设计简单,耗时短、效率高等优点使其成为一项具有广阔应用前景的基因靶向敲除技术。就CRISPR-Cas的发现、结构、作用机理以及Cas9/gRNA目前的一些应用进行综述。

摘要：本研究通过PCR技术克隆苏禽黄鸡CVH基因的CDS区,分别构建真核表达载体pcDNA3.1-CVH和pEGFP-C1-CVH,并用pcDNA3.1-CVH载体免疫小鼠制备多克隆抗体。pcDNA3.1-CVH和pEGFP-C1-CVH分别转染COS-7细胞,进行间接免疫荧光实验和CVH-EGFP融合蛋白亚细胞定位,并通过RT-PCR、Western blot进一步检测蛋白的表达。结果表明:克隆出CVH基因的完整CDS,构建了真核表达载体pcDNA3.1-CVH和pEGFP-C1-CVH,成功制备了多克隆抗体,转染后观察CVH基因表达产物定位于细胞质中,RT-PCR和Western bolt分别检测到1 989 bp特异条带和100 ku的融合蛋白。真核表达载体制备的多克隆抗体特异性良好,效价为1∶200,CVH基因蛋白在细胞质中表达,为进一步探讨CVH基因的生物学特性建立基础。

摘要：克隆如皋黄鸡LBC(Libichun)基因CDS区,通过GFP-LBC融合蛋白和间接免疫荧光法(IFA)来实现该基因的亚细胞定位,为其基因功能研究奠定基础。提取如皋黄鸡18日龄的鸡胚睾丸RNA,巢式PCR方法扩增LBC基因的CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N1-LBC转染DF-1细胞,48h后观察其绿色荧光表达情况,同时制备LBC基因的多克隆抗体,利用IFA标记LBC基因的表达部位。本研究成功克隆出如皋黄鸡LBC基因的完整编码区,成功制备抗体和构建pEGFP-N1-LBC、pcDNA3.0-LBC。GFP-LBC融合蛋白和IFA的结果显示,如皋黄鸡LBC基因在细胞质和细胞核中都有表达,为下一步LBC基因的功能研究奠定了基础。

摘要：为了筛选NOS2在鸡雄性生殖细胞形成过程中的互作蛋白,通过克隆NOS2序列,构建pGEX-6p-NOS2原核表达载体且诱导表达NOS2蛋白,采用GST pull-down联合质谱分析技术筛选与鸡NOS2相互作用的蛋白质。结果显示:经GST pull-down质谱分析鉴定到316个与鸡NOS2相互作用的候选蛋白质,其中12个高评分蛋白具有相同的功能注释,参与精子运动调控,且主要分布在细胞质、细胞核等细胞组分中,可能通过与其它蛋白质、核酸等分子结合而参与MAPK、Notch等信号通路;质谱分析还发现GOT1蛋白与NOS2互作最为明显,该蛋白参与Notch信号通路,后续将作为重点候选互作蛋白以探究其与NOS2蛋白的互作方式。该结果为进一步探究NOS2在鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化中的调控机制奠定了实验基础。

摘要：研究旨在对前期测序筛选到的关键LncPGCT8对鸡原始生殖细胞(PGCs)形成的影响进行深入探究。试验通过qRT-PCR和组织表达谱分析LncPGCT8在鸡PGCs和生殖嵴中的表达量。在体内外过表达/干扰LncPGCT8,通过qRT-PCR、流式细胞术、间接免疫荧光和免疫组织化学染色检测体内外PGC形成效率。结果显示:LncPGCT8在鸡PGCs和性腺中均显著高表达(P<0.05),过表达LncPGCT8组PGCs形成效率显著高于对照组(P<0.05),干扰LncPGCT8则会显著降低PGCs形成数量(P<0.05)。结果表明LncPGCT8在体内/外均促进鸡PGCs形成,为提高体外诱导PGCs效率奠定理论基础。

摘要：研究旨在对鸡胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)向鸡精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSC)分化过程中显著差异基因——丝裂原活化蛋白激酶8(Mitogen-activated protein kinase 8,MAPK8)进行生物信息学分析,验证MAPK8慢病毒干扰载体活性及干扰效率,为后期验证MAPK8在ESC向SSC分化过程中的调控方式以及功能研究奠定基础。试验采用RNA-seq和qRT-PCR分析和检测鸡ESC、PGC和SSC的差异表达基因;利用生物信息学在线预测软件对其进行理化性质及结构特征分析;比较鸡MAPK8基因序列与其它物种的同源性并进行组织表达谱检测;验证MAPK8慢病毒干扰载体的活性与干扰效率。结果显示:MAPK8在SSC上特异高表达;生物信息学分析显示鸡MAPK8是一种亲水性的无信号脂溶性蛋白,存在2个N-糖基化位点、13个O-糖基化位点和45个磷酸化位点,与其它物种高度同源(序列一致性达到80%),保守性较高;表达谱分析发现其在性腺中高表达;MAPK8慢病毒干扰载体能够稳定表达EGFP荧光蛋白且shRNA-1干扰效率最佳。该结果为深入探究MAPK8在鸡ESC向SSC分化过程中的功能奠定了基础。

摘要：本文旨在探究差异代谢物泛酸(PA)和脂肪酸氧化(FAO)在鸡胚胎干细胞(ESCs)向原始生殖细胞(PGCs)分化过程中的作用,为从代谢角度解析PGCs形成机制提供新的理论基础。采用BMP4诱导体系,基于课题组前期对泛酸及其抑制剂(PZ)和脂肪酸氧化激活剂(BMS)/抑制剂(Per)的最适添加浓度,设置5个分组:Control组、PA+BMS组、PA+Per组、PZ+BMS组、PZ+Per组。通过观察细胞形态、qRT-PCR检测PGCs特异标记基因、间接免疫荧光和流式细胞分选等探究泛酸代谢及其下游的脂肪酸氧化在ESCs向PGCs分化过程中的作用。细胞形态观察结果显示,诱导至第6天,PZ+BMS组的类胚体数目显著升高(P<0.01),PA+Per组显著减少(P<0.05);qRT-PCR结果显示,CVH和C-KIT在PZ+BMS诱导组中的表达量极显著升高(P<0.01),而在PA+Per组中的表达量则显著降低(P<0.01);间接免疫荧光和流式细胞分选结果显示,PZ+BMS组DDX4阳性细胞率显著高于对照组(P<0.05),而PA+Per组DDX4阳性细胞率极显著低于对照组(P<0.01)。以上结果表明,抑制泛酸代谢并激活脂肪酸代谢能够促进PGCs的形成,该研究为利用代谢物完善PGCs的体外诱导培养体系提供新见解。