摘要：2017年初在中国出现的H7N9流感病毒变异株表现出对禽高致病性的特征,根据高致病性H7N9流感病毒(HP-H7N9)的HA基因序列,设计1组HP-H7N9特异性的引物和探针,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性、敏感性和重复性试验,制作了标准曲线。结果显示,本方法只对HP-H7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到35.45 copies的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法的建立将为HP-H7N9的诊断、监测和防控提供快速、特异、敏感的技术手段。

摘要：将重组酶介导等温扩增技术(RAA)与成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白12a(CRISPR-Cas12a)检测系统相结合,针对白斑综合征病毒(WSSV)建立快速、灵敏、特异的DNA内切酶靶向CRISPR反式报告(DETECTR)检测系统。针对WSSV保守基因设计RAA引物与crRNA,通过实验筛选最优组合和最佳反应条件,构建WSSV DETECTR检测系统。对该系统进行灵敏度与特异性测试,与WOAH推荐的Real-timePCR和NestedPCR检测方法比较。结果显示,WSSV DETECTR检测系统最低检出限为10copies/μL,灵敏度与Real-time PCR、Nested PCR检测方法相当(均为3.34×10^(1)copies/μL),与其他病原之间无交叉反应,与Real-time PCR、Nested PCR对临床样本的检测结果相一致。结果表明,建立的WSSV DETECTR检测系统具有快速简单、灵敏、特异等优点,为白斑综合征病毒的快速检测提供了新的方法。

摘要：根据传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)基因序列的保守区域设计并合成多组RPA引物和特异性crRNA,经过筛选与优化,建立RPA-Cas12a系统荧光检测法和试纸条法2种可视化快速检测IHHNV的方法。结果显示,这2种可视化检测方法在37℃恒温反应40 min可检测出IHHNV;与对虾白斑综合征病毒、虾肝肠胞虫和十足目虹彩病毒1无交叉反应;该方法灵敏度较高,最低检测浓度为10 copies/μL;应用该方法对10份IHHNV阳性临床样本进行检测,阳性检出率为100%。综合结果表明,建立的荧光法和试纸条2种可视化检测IHHNV的方法操作简单,反应灵敏,适用于对虾养殖场或基层实验室对IHHNV的定期监测和初筛。

摘要：为探索16S rRNA基因条形码技术在濒危脊椎动物物种鉴定中的可行性,选取脊椎动物线粒体16S rRNA基因中长度为286 bp的片段设计通用引物,以哺乳纲(Mammalia)、爬行纲(Reptilia)、两栖纲(Amphibia)、软骨鱼纲(Chondrichthyes)和辐鳍鱼纲(Actinopterygii)中24科、28属、40种共71个濒危脊椎动物样本为研究对象,进行PCR扩增并对扩增产物进行纯化、测序和基因序列分析。结果显示:建立的检测方法灵敏度可以达0.001 ng/μL,其中62个(39个物种)样本扩增成功,57个样本(34个物种)测序结果与GenBank数据库中的参考序列具有较高相似度,可以鉴定到种的水平。测序所得的基因序列与参考序列的种内遗传距离为0~0.5%、种间遗传距离为1.0%~39.9%,最小种间遗传距离大于最大种内遗传距离,即存在明显的条形码间隔;另外5个样本(5个物种)测序结果在属内种间高度一致,只能鉴定到属的水平。基于16S rRNA基因片段构建的条形码可对濒危脊椎动物进行种属鉴定,可为濒危物种保护、打击非法走私等提供技术支撑。

摘要：重组酶介导的等温核酸扩增(RAA)技术是一种新的检测技术,本研究分别基于猪丹毒CPS基因序列和猪肺疫KMT基因序列,使用分子生物学软件Oligo 7.0分别设计两套特异性引物、探针,建立猪丹毒、猪肺疫的RAA检测方法,并分别对其特异性、灵敏度和稳定进行测试。结果显示,所建立的两种方法将巴氏杆菌、丹毒杆菌显著区分于大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌、单核细胞增生李斯特菌、支气管败血波氏杆菌、Ⅱ型猪链球菌等其他猪细菌性传染病病原,单个样品检测时间约20分钟,最低均可检测到100个拷贝数量级的重组质粒DNA。

摘要：2017年2月广东CDC首次报告了一种新的H7N9流感病毒变异株,该变异株在血凝素(HA)基因的裂解位点发生了插入型突变,从而成为对禽高致病性的H7N9流感病毒(HP-H7N9)。因此,急需建立一种快速简便的H7N9流感病毒检测方法。根据HP-H7N9的HA基因序列,设计一组HP-H7N9特异性的RT-LAMP引物,在对反应体系进行优化的基础上,建立了HP-H7N9的RT-LAMP检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验。结果显示,本方法只对HP-H7N9特异性扩增,而对低致病性H7N9病毒(LP-H7N9)、H7N3流感病毒(H7N3)、H3N2流感病毒(H3N2)、H5N1禽流感病毒(H5N1)、H9亚型禽流感病毒(H9)、新城疫病毒(NDV)、甲型H1N1流感病毒(H1N1)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)等病原未见扩增。该方法最低能够检测到2.97×105 copies(10-6稀释度)的阳性质粒,具有良好的检测灵敏度。本方法操作简便,对设备需求较低,试验耗时短,反应结果可直接肉眼观察判读,适用于基层兽医站所、养殖场及野外监测点的HP-H7N9的快速筛查和监测。

摘要：利用沙门氏菌fim Y基因设计特异性引物、探针,优化叠氮溴化丙锭(propidium azide bromide,PMA)染料浓度及相关反应条件,使用高亮度蓝色发光二极管(Light Emitting Diode,LED)光解仪代替卤素光源,建立了食品中沙门氏菌活菌的Taq Man实时荧光PCR快速检测方法。实验表明,设计的引物、探针特异性强,能特异性扩增7株沙门氏菌,其他非沙门氏菌均无扩增,对沙门氏菌纯培养物检测灵敏度可达102 CFU/m L。经反应条件优化后,在PMA浓度为20μmol/L,暗反应5 min,曝光反应10 min条件下,对106 CFU/m L的沙门氏菌热致死菌抑制效果最好,活菌的扩增不受影响。利用优化的PMA处理方法结合Taq Man实时荧光PCR和不经PMA处理的Taq Man实时荧光PCR,分别检测3种不同浓度(5 CFU/25 g、50 CFU/25 g、500 CFU/25 g)活菌和高浓度死菌(106 CFU/25 g)的沙门氏菌人工混合污染样品,以及仅高浓度沙门氏菌死菌污染的人工污染样品。结果显示,2种方法检测沙门氏菌活菌和沙门氏菌死菌的人工混合污染样品的结果均为阳性,只添加沙门氏菌死菌的人工污染样品PMA处理组扩增结果为阴性、不经PMA处理对照组为阳性,表明优化后的PMA处理方法排除了沙门氏菌死菌对Taq Man实时荧光PCR假阳性的影响,并可以有效检出食品样品中的沙门氏菌活菌。食品样品增菌后的沙门氏菌活菌检测过程只需4~5 h,本研究为食品中沙门氏菌活菌的快速检测提供了一种科学有效的方法。

摘要：建立一种叠氮溴化乙锭结合荧光PCR(Ethidium monoazide bromide real-time PCR,EMA-RT-PCR)快速检测沙门氏菌活菌的技术。以沙门氏菌f imY基因为靶点设计特异性引物,通过菌液浓度及叠氮溴化乙锭(Ethidium monoazide bromide,EMA)相关反应条件的优化,建立沙门氏菌活菌的EMA-RT-PCR方法。经反应条件优化后,当EMA浓度为2.5μg/mL,暗反应5 min,曝光反应10 min条件下对10^(6)CFU/mL的沙门氏菌抑制效果最好,活菌的扩增没有影响,死菌的扩增受到抑制,所构建的沙门氏菌EMA-RT-PCR方法的检测灵敏度为2.5×10^(2)CFU/mL。用该方法检测8批次受沙门氏菌人工污染的阳性样品,结果显示该方法均能正常检出带活菌的样本,检测时间为4~5 h,比传统检测时间大大缩短。EMA-RT-PCR方法能准确区分活死菌,适合作为沙门氏菌的快速初筛方式。

摘要：目的为了高效检测棘球绦虫(Echinococcus)。方法针对棘球绦虫的线粒体基因高度同源区域设计特异性引物和探针,建立了一种检测棘球绦虫的荧光PCR检测方法。在优化反应条件并测试灵敏度和特异性之后进行样本检测。结果该方法有较高的灵敏度,检测质粒浓度极限为10 copies/μL;特异性好,未见非特异性扩增;应用该方法对84份犬粪样本进行检测,发现41份样本为阳性。结论本研究所建立的荧光PCR方法可快速、准确地检测棘球绦虫,为棘球蚴病的早期诊断和预防提供了技术支撑。

摘要：本研究根据GenBank中已有的虾肝肠胞虫(EHP)和虾血细胞虹彩病毒(SHIV)基因的保守序列,设计特异的引物和探针。建立了快速诊断EHP和SHIV的双重TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、敏感性和稳定性进行检测。结果表明:该方法检测限可达10 copies/μL,其敏感性是SYBR Green real-time PCR的10倍,普通PCR法的100倍;对白斑综合征病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、高致病性副溶血弧菌,以及桃拉综合征病毒的检测结果均为阴性,表明无交叉反应,具有良好特异性;重复性试验结果表明,该方法Ct值的变异系数小于4%,具有良好的稳定性。对37份已知检测结果的样品进行检测,结果符合率为100%。本研究建立的EHP和SHIV检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等优点,适用于对虾隐性感染的早期监测。