摘要：为了建立一种能广泛应用于临床快速、简便、灵敏度和特异性较好的风疹病毒（RV）定量诊断方法。针对RV基因保守序列设计两对引物和一条荧光双标记探针。将PCR扩增所得到的产物片段克隆，作为定量检测的标准品，进行Real—timePCR检测，绘制标准曲线。将此方法和ELISA试剂盒平行检测50份孕妇血清，评估两种方法检出阳性率的差异显著性。Real—timePCR法能较好地检出RVcDNA载量。曲线的相关系数（r）为0．998，可检测线性范围大约在10^3～10^9copies／μl，灵敏度接近10^3copies／μl；批间、批内CV值分别为3．36％、0．94％；也有较好的特异性。与经典的ELISA方法相比，有显著性差异。Real—timePCR方法操作简单、快速，并能避免PCR后处理导致的假阳性污染，实现实时定量。此方法对RV感染的临床诊断和疗效判断等方面有较大的指导意义。

摘要：目的探讨有丝分裂期检查点蛋白BubR1在乳腺癌细胞发生紫杉醇耐药中的作用。方法设计并合成针对BubR1基因的特异性干扰RNA(siRNA)片段,连接入穿梭质粒后,包装成腺病毒(Ad-BubR1-siRNA),感染MCF-7细胞,采用实时荧光定量RT-PCR和Western blot法评价BubR1干扰对MCF-7细胞BubR1基因和蛋白表达的影响。分别通过cck8试验、染色体计数分析、细胞集落生成试验、Hochest染色和细胞划痕试验评价干扰BubR1后,MCF-7细胞在紫杉醇作用下增殖、染色体稳定性、凋亡及迁移能力等生物学功能。结果重组腺病毒的滴度为1010 pfu/ml,其能有效抑制BubR1基因在mRNA和蛋白水平的表达。干扰BubR1表达后,MCF-7细胞在紫杉醇作用下表现为增殖和迁移能力增强,染色体不稳定性增加,集落生成能力增强,凋亡能力下降。结论下调BubR1基因可能导致乳腺癌细胞MCF-7对紫杉醇的耐药性增强。

摘要：目的利用二聚体蝎型荧光探针技术,建立一种能用于临床的快捷、敏感、特异、价格低廉的HBV实时荧光定量PCR检测方法。方法根据HBV基因组保守区域precore/core设计二聚体蝎型荧光探针和引物,构建质粒标准品,优化荧光定量PCR条件,并进行方法学评价。结果所建方法的检测范围为101～108copies/μl,灵敏度达到10copies/μl,低拷贝样品的批内和日间重复性(CV)分别为1.71%和2.57%,高拷贝样品的批内和日间CV分别为3.00%和3.86%。与商品化TaqMan试剂盒相比,本法阳性检出率较高,且检测时间缩短了45min(约减少1/3),成本降低50%。结论成功建立了快速检测HBVDNA的二聚体蝎型荧光定量PCR方法,为研发适合临床应用的HBV基因定量检测试剂盒奠定了基础。

摘要：目的研究siRNA特异性沉默Smad3基因对人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloidfibroblast,KFB)增殖、凋亡及合成基质金属蛋白酶3(matrix metalloproteinase3,MMP3)的影响。方法设计合成3对Smad3特异性siRNA片段(Smad3-siRNA-Y1,Y2,Y3)和1对无关干扰片段,转染人KFB细胞,RT-PCR和Western blot方法检测Smad3-siRNA片段对Smad3基因的特异性沉默效果,MTT法检测其对细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡的变化,免疫细胞化学法检测MMP-3表达量的变化。结果75nmol/L Smad3-siRNA-Y1处理KFB细胞48小时后可特异并有效地抑制Smad3基因的表达;抑制细胞增殖,使S期细胞减少,G0/G1期细胞增多;凋亡指数增加;细胞表达MMP-3增加。结论Smad3-siRNA可特异性抑制KFB细胞中Smad3基因表达,明显抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,并加快其合成MMP3。

摘要：天蚕素A(Cecropin A,CA)是来源于惜古比天蚕(Hyalophoracecropia)的含有37个氨基酸的抗菌肽,在非极性环境中形成α螺旋型结构,具有抗菌活性强、抗菌谱广等特点。为降低天蚕素A对宿主的毒性及提高其表达丰度和稳定性,在序列分析的基础上设计了3条天蚕素A氨基酸序列,分别为CA19、CA36和CA210。根据大肠杆菌密码子的偏爱性分别合成相应的3对寡核苷酸链,并通过重叠PCR方法合成成熟肽CA。将含有CA19、CA36、CA210和CA1～5个拷贝基因的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)和BLR(DE3)PlysS,成功构建了串连融合表达载体,为下一步的抗菌活性及免疫表位的分析打下基础。

摘要：目的:研究shRNA对肝癌细胞株HepG2中COX-2基因表达的抑制作用,同时检测对细胞周期和细胞生长的影响。方法:设计、合成一对环氧化酶-2(COX-2)基因编码的反向重复序列,中间间隔9个核苷酸序列,定向克隆至质粒载体pGenesil-1,构建抑制COX-2基因的短发夹RNA(short hairpin RNA shRNA)的重组表达质粒pshRNA-COX-2,用脂质体LipofectamineTM2000转染肝癌细胞HepG2,经RT-PCR和Westernblot分别检测pshRNA-COX-2重组表达质粒对COX-2mRNA和蛋白抑制效应,流式细胞仪检测细胞周期、细胞计数检测细胞生长变化。结果:pshRNA-COX-2重组表达质粒能够抑制COX-2基因表达。与未转染肝癌细胞HepG2相比,pshRNA-COX-2重组表达质粒转染肝癌细胞后,COX-2mRNA和蛋白表达明显降低,抑制率分别为69.9%和50.3%;G0-G1期细胞由55.4%上升为77.9%,S期细胞由31.1%下降为16.2%;细胞生长明显减慢。结论:构建的pshRNA-COX-2重组表达载体能够显著抑制COX-2基因表达;引起G0-G1期细胞增多,S期细胞减少,从而阻止肝癌细胞生长。

摘要：目的构建核仁磷酸蛋白1(nucleophosmin1,NPM1)特异性的RNAi真核表达载体,观察对白血病K562细胞系NPM1表达的抑制作用。方法采用RT-PCR检测白血病细胞系(THP1和K562)和急性髓系白血病(AML)细胞NPM1mRNA水平。设计合成2条针对NPM1基因并具有小发夹结构的DNA序列,经退火形成互补双链,再克隆至载体pGenSil-1中构建含NPM1的RNAi重组体,经酶切及测序鉴定后通过脂质体转染K562细胞,同时设立pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组。采用RT-PCR检测各组转染细胞中NPM1的mRNA水平。结果白血病细胞系和AML细胞均高表达NPM1 mRNA。针对人NPM1基因的RNAi重组体构建成功,并能够稳定转染K562细胞,导致白血病细胞NPM1mR-NA相对表达量下降64%,而pGenSil-1转染组和pGenSil-1/neg转染组未能下调NPM1表达。结论白血病细胞高表达NPM1基因,其mRNA表达水平能够被靶向NPM1的RNAi重组体特异性地下调。

摘要：对肺炎链球菌双组份系统中的组氨酸激酶YycG进行同源模建,并分析其与底物ADP的相互作用,为寻找特异性的激酶抑制剂提供了理论依据。采用同源模建的方法构建YycG蛋白的三维结构,并用ProCheck、Profile_3D软件对此结构模型的合理性进行验证;用Autodock4.0软件将结构模型与ADP进行自动对接,分析二者之间的相互作用。序列比对结果显示肺炎链球菌YycG蛋白与Thermotoga maritima X-ray晶体结构序列的同一性达33%;YycG模建后的结构与模板能很好的叠合;在活性口袋处的保守的氨基酸残基Asn145、Asn149、Lys152以及口袋内部的疏水残基在结合、水解底物ADP的过程中发挥重要作用。组氨酸激酶YycG的模建合理,该结构模型可作为设计抗菌药的研究起点。

摘要：根据CyclinE(细胞周期蛋白E)基因序列,设计siRNA干扰序列,将带9个碱基茎环结构的干扰序列插入带U6启动子真核表达载体,构建针对CyclinE基因的shRNA真核表达载体.酶切和测序鉴定确认载体构建成功后,脂质体法转染宫颈癌HeLa细胞,观察绿色荧光蛋白表达检测转染效率,RT-PCR法检测载体对CyclinE基因的表达抑制效果.实验结果显示CyclinE基因的RNAi真核表达载体构建成功,转入HeLa细胞后可以特异抑制细胞中CyclinE基因的表达.其中靶向(+797^+819)位点的质粒干扰效果较好,基因表达抑制率为59%.这些结果为利用该载体抑制CyclinE基因进行宫颈癌基因治疗研究奠定了基础.

摘要：目的研究阿奇霉素(azithromycin,AZM)联合亚胺培南(imipenem,IPM)对肺炎克雷伯菌生物膜(biofi lm,BF)的抑制作用。方法采用改良平板法建立肺炎克雷伯菌BF模型,微量稀释法测定抗菌药物的最低抑菌浓度,银染法快速鉴定细菌BF,噻唑蓝(MTT)比色法测定BF中的活菌数,棋盘设计法测定阿奇霉素和亚胺培南对BF的协同抑制作用,用RT-PCR对联合用药前后luxS基因的表达进行相对定量分析,检测结果采用SPSS13.0软件进行统计处理。结果加入1/16、1/4MIC阿奇霉素可显著增加1/4、1/2及1MIC亚胺培南对肺炎克雷伯菌BF的抑菌活性;加入1/4、1/2及1MIC的亚胺培南也可显著增加1/16、1/4MIC阿奇霉素的抑菌活性;1MIC IPM与1/4、1/16MIC AZM联合应用;1/2MIC IPM与1/4MIC AZM联合应用可以下调lux S基因的表达。结论阿奇霉素与亚胺培南联合使用可下调肺炎克雷伯菌lux S基因的表达,从而增强其对BF的抑菌活性。