摘要：谷胱甘肽(GSH)在生物细胞抵御外界环境条件的刺激和胁迫时起到非常重要的作用.研究发现,高产GSH的产朊假丝酵母(Candidautilis)在受到低pH胁迫时,能以增加GSH合成并向胞外释放GSH的方式来响应和抵御外界pH的不断降低.根据这一生理现象,设计了一种pH控制策略,即在***0208发酵过程中,对细胞赋予短时间pH胁迫,以期提高其胞内GSH合成能力,并使GSH向胞外分泌,从而改变GSH在胞内外的分布和增加GSH合成总量.在该发酵策略的控制下,GSH总产量达到737.1mg·L-1,比对照(A:初糖浓度60g·L-1,恒定pH=5.5,培养时间48h;B:初糖浓度30g·L-1,24h一次性补料30g·L-1,恒定pH=5.5,培养时间45h)分别高出24.9%和20.0%;胞外GSH含量达到197.3mg·L-1,比对照(A、B同前)分别高出355.7%和455.8%;单位细胞的GSH含量达到2.67%(mass),而对照仅为2.28%(mass)和2.11%(mass).研究表明,基于微生物细胞的生理特性设计发酵策略,可以较大幅度地提高目标发酵产物的产量.

摘要：采用烯丙基缩水甘油醚对国产交联琼脂糖凝胶进行活化,与巯基乙酸反应后,偶联N-羟基丁二酰亚胺(NHS),得到连接臂长度为10个原子、具有对氨基高度特异性的琼脂糖凝胶活化中间体.通过控制琼脂糖凝胶活化双键的量,可使NHS的修饰密度处在较宽范围(20～150μmol/mL),有效减少介质上杂基团的引入并有利于配基密度的设计.活化过程对介质的理化性能无明显影响,活化介质在30min内即可完成对L-苯丙氨酸的偶联,效率在90%以上,且在多种溶液中贮藏30d后配基稳定性良好,几乎无泄露.

摘要：20世纪后半叶,随着蛋白质与核酸测序技术的问世,人类所掌握的生物大分子结构与功能的信息量暴涨,并逐渐进入了理性设计序列,以达到建构生物大分子功能性三级结构的自由王国。随着21世纪的到来,得益于多学科交叉集成,DNA技术中的创新性设计智慧此起彼伏。人类成功重装了低等生命的基因组,设计基因组底盘、构建人工进化平台,推出CRISPR基因编辑术,发明DNA折纸术,精确自组装纳米级三维DNA材料。另外,可将设计学的立体构成原理与基于用户体验的设计方法应用于生物信息学数据库建设。

摘要：建立并完善了谷氨酸棒杆菌GWY020及其2个逐步叠加不同遗传标记的突变株HUI821和GUI089合成L-精氨酸的中心代谢网络。分别测定了它们在特定培养时段(50h^52h)L-精氨酸等代谢物的胞外浓度,由此计算这一时段这些代谢物在发酵液中积累(或消耗)的速率,分别作出这3株菌在拟稳态下的代谢流量分布图,进而研究育种过程中不同遗传标记的叠加对代谢网络中L-精氨酸合成流量分布的影响。结果表明遗传标记的引入使流量分配发生了重大变化,节点处的流量分配朝着有利于L-精氨酸合成的方向改变。从代谢流量分析角度上,证明结构类似物抗性和敏感性突变是代谢流导向和设计育种的有效手段,代谢流量分析将成为设计育种的提供新思路。

摘要：从抗生素入手 ,介绍了次生代谢产物菌种改良的策略和手段 ,从代谢工程角度讨论了在初级代谢产物育种中行之有效的设计育种“五字策略” ,以及在次生代谢产物生产菌种选育方面的应用前景 .

摘要：T1脂肪酶来源于Geobacillus zalihae菌株,常作为生物催化剂广泛应用于各领域。为了综合改善T1脂肪酶的酶学性质,前期通过对该酶盖子结构进行理性设计得到3个效果较好的突变体L188M、A190L、A190Y,在此基础上,将单点突变体进行组合得到L188M/A190L和L188M/A190Y两个复合突变体。在该实验中对突变体脂肪酶酶学性质展开研究,同时将单点与组合突变效果进行比较。结果显示野生型及突变体最适pH均为9.0,复合突变体的最适温度提高5℃。单点突变及组合突变均使T1脂肪酶的酶学性质得到不同程度的改善,且复合突变体效果更显著。组合突变体使脂肪酶的温度、pH稳定性显著提高,L188M/A190L对于有机溶剂二甲基亚砜及正十六烷的耐受性为野生型的1.88倍和2.73倍,L188M/A190Y为野生型的1.96倍和2.58倍。此外,对C16和C18底物的选择性也明显增强,L188M/A190L为野生型的1.65和2.7倍,L188M/A190Y为野生型的1.5倍和2.25倍。该研究成果在一定程度上拓宽了T1脂肪酶的应用前景,同时为其他脂肪酶的改造提供了一定理论依据。

摘要：为解决发酵行业传统操作模式的弊端问题,利用Python 3.6设计并开发了BioJN发酵技术服务系统PC端。BioJN系统PC端具有简单明了的操作界面和功能齐全的数据可视化模块,依靠MySQL数据库建立了用于存储、检索和管理数据的完整数据库系统,且在通信模块预留了DDE、OPC DA、OPC UA三种通信接口用于数据采集。BioJN系统PC端可将本地采集到的数据上传至云服务器,与研究团队已搭建好的服务器配合使用,可实现用户权限管理、发酵数据管理和发酵设备远程监控与控制的功能。利用BioJN系统PC端连接不同的发酵设备进行多次发酵实验,在实验过程中充分验证了其有效性和通用性。结果表明,BioJN系统PC端的各个功能模块都能够稳定运行,达到预期效果。

摘要：肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖。肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.1.3.17)是肝素和硫酸乙酰肝素合成过程中重要的修饰酶,催化N-硫酸化肝素前体(N-sulfoheparosan)的D-葡萄糖醛酸(D-GlcA)上5号位羧基翻转生成L-艾杜糖醛酸(L-iduronic acid,L-IdoA)。文中以大肠杆菌Escherichia coli为宿主对斑马鱼来源的肝素葡萄糖醛酸C5异构酶基因Glce进行重组表达优化与分子改造。比较了3种不同的表达载体pET20b(+)、pET28a(+)和pColdⅢ对C5表达的差异情况,其中以嗜冷启动型载体pColdⅢ表达酶活最高,达到(1873.61±5.42)U/L。为了进一步提高C5的可溶表达量,在N端融合促溶标签SET2后,可溶蛋白表达量比对照提高了50%,酶活达到(2409.25±6.43)U/L。在此基础上,通过理性设计对底物结合口袋进行定点突变,获得最优突变体(V153R)的酶活和比酶活分别为(5804.32±5.63)U/L和(145.14±2.33)U/mg,是原始酶的2.41倍和2.28倍。肝素C5异构酶改造与表达优化为酶法催化合成肝素奠定了基础。

摘要：来源于粉红螺旋聚孢霉Clonostachys rosea的玉米赤霉烯酮水解酶(ZHD101)可以有效降解谷物农副产品和饲料中的霉菌毒素玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN),但是,该酶的热稳定性较低,限制了其在工业中的应用。由于水解ZEN的反应没有吸光值的变化,不适合高通量筛选。本文以ZHD101为模式酶,进行计算虚拟突变并结合实验验证。通过比对不同温度下的分子动力学模拟轨迹,选取32个柔性位点;再通过位置特异性评分和酶构象自由能计算,从32个柔性位点上的608个虚拟饱和突变体中筛选出12个突变体。经实验验证,其中3个突变体N156F、S194T和T259F的热熔融温度有一定程度的提升(ΔT_(m)>4℃),且酶活性与野生型类似甚至更高(相对酶活性为95.8%、131.6%和169.0%)。分子动力学模拟分析显示,导致3个突变体热稳定性提高的可能作用机理分别为NH-π作用力、盐桥重排和分子表面空穴填充。将3个突变体进行迭代组合突变,N156F/S194T表现出最高的热稳定性(ΔT_(m)=6.7℃)。这项工作表明基于柔性区域的虚拟饱和突变在酶稳定性改造上的可行性,探索计算虚拟改造结合实验验证的酶改造策略。

摘要：亮氨酸脱氢酶(Leucinedehydrogenase,LDH)是制备L-2-氨基丁酸的关键限速酶,针对该酶的Loop区域进行改造以提高关键酶的酶活及稳定性从而高效合成L-2-氨基丁酸。通过亮氨酸脱氢酶的分子动力学模拟分析均方根涨落(Root mean square fluctuation,RMSF)值,对其波动非常明显的Loop区域合理设计以得到比酶活提高的截短突变体EsLDHD2,其比酶活为野生型的123.2%;此外,由于L-2-氨基丁酸制备过程中苏氨酸脱氨酶催化L-苏氨酸制备2-酮丁酸的速率过快导致多酶催化不平衡,因此双拷贝亮氨酸脱氢酶及甲酸脱氢酶以平衡多酶催化速率,构建多酶级联催化的单细胞***21/pACYCDuet-RM,其摩尔转化率相较于***21/pACYCDuet-RO提高74.6%;对菌株E. coli BL21/pACYCDuet-RM的全细胞转化条件进行优化,其最适pH、温度、底物浓度分别为7.5、35℃和80 g/L,此时摩尔转化率大于99%;在1 L转化体系和最适转化条件下分批加入L-苏氨酸80 g和40 g,L-2-氨基丁酸的产量达97.2g。总之,该策略为L-2-氨基丁酸的制备提供了绿色、高效的合成方法,具有工业化制备药物前体的巨大潜力。