摘要：目的了解细粒棘球绦虫的乳酸脱氢酶蛋白基因的生物信息学特性,并进行原核表达。方法利用NCBI网站登录的细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶基因序列设计特异性引物和qRT-PCR引物,使用PCR扩增细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶基因,使用荧光定量法检测细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶在不同发育阶段的相对表达量,使用生物信息学软件对细粒棘球绦虫乳酸脱氢酶蛋白进行分析;构建重组pET28a-EgLdh质粒,转进大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,并通过Western blot对蛋白进行免疫原性分析;利用原核表达重组pET28a-EgLDH蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,通过间接免疫荧光分析其在虫体上的分布。结果生物信息学分析发现EgLDH全长996 bp,编码331个氨基酸,分子式为C_(1575)H_(2561)N_(425)O_(470)S_(17),相对分子质量为35516.25,理论等电点为6.32,不稳定指数为27.96,显示为稳定蛋白,脂肪系数为106.83,亲水性为0.236,为疏水性蛋白,有13个潜在的B细胞抗原表位;通过双酶切鉴定及测序分析证明,pET28a-EgLDH重组质粒构建成功。重组质粒pET28a-EgLDH转化大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞后使用IPTG成功诱导表达蛋白,分子质量约为40 ku,Western blot结果显示,重组蛋白能被感染棘球蚴的犬阳性血清识别,表明其均具有良好的反应原性。EgLDH在细粒棘球绦虫阶段的相对转录水平显著高于原头蚴阶段。间接免疫荧光分析显示其定位在原头蚴的表皮层。结论rEgLDH具有较好的免疫活性,是一种潜在的疫苗候选抗原。

摘要：为了探究苹果酸脱氢酶(malate dehydrogenase,MDH)基因在细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)生长发育中的生物学功能并初步评价MDH作为疫苗候选抗原的潜力,从NCBI GenBank数据库中获得Eg MDH基因序列,设计特异性引物,以细粒棘球绦虫原头蚴的cDNA为模板,用PCR扩增MDH基因全长序列;采用生物信息学软件对MDH蛋白的理化性质、结构特点等进行分析;构建重组质粒pET28a-MDH并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,利用SDS-PAGE检测蛋白的表达,随后纯化、复性蛋白,并通过Western-blot对蛋白进行抗原性分析;利用间接免疫荧光试验检测原头蚴中目的蛋白的定位;应用实时荧光定量PCR分析Eg MDH基因m RNA在原头蚴及成虫中的相对转录水平。生物信息学分析结果显示,Eg MDH基因长999 bp,编码332个氨基酸,蛋白分子式为C1639H2599N445O475S16,相对分子质量为36 651.32,理论等电点为8.11,且编码蛋白没有信号肽和跨膜区,含有40个磷酸化位点,3个N连接型糖基化位点,9个优势B细胞抗原表位。二级结构由α-螺旋(46.69%)、无规则卷曲(31.93%)、延伸链结构(16.87%)和β-转角(4.52%)构成。克隆的基因长975 bp,预测分子质量为35.7 ku;Western-blotting显示,重组蛋白可以被抗His标签的家兔多克隆抗体和原头蚴可溶性全蛋白小鼠多克隆抗体识别;间接免疫荧光试验显示,Eg MDH蛋白定位在原头蚴的囊壁;实时荧光定量PCR显示,Eg MDH基因在成虫及原头蚴中均有表达,且原头蚴阶段的转录水平显著高于成虫(P<0.05)。本研究结果初步表明Eg MDH具有作为疫苗候选抗原的潜力,以期为后续细粒棘球绦虫疫苗研发提供候选抗原;同时也为后续细粒棘球绦虫MDH基因的深入研究奠定了基础。

摘要：为阐明绵羊谷胱甘肽S转移酶α2(Glutathione S-transferase alpha 2,GSTA2)基因功能,利用牛GSTA2基因序列设计引物,提取绵羊皮肤组织总RNA,应用RT-PCR、基因克隆、生物信息学对GSTA2基因进行研究,构建真核表达载体,转染绵羊皮肤成纤维细胞,应用qPCR技术检测GSTA2基因的表达。结果表明,克隆到绵羊GSTA2基因672 bp编码区序列(GenBank登录号:OR440604.1),编码223个氨基酸,分子量为25.39 ku。氨基酸比对和系统进化树分析表明,绵羊与牛的GSTA2相似度最高,达87.39%。GSTA2的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。构建的真核表达载体pcDNA3.1-GSTA2转染绵羊皮肤成纤维细胞后,GSTA2基因表达量极显著上调(P <0.001)。说明成功克隆了绵羊新基因GSTA2的CDS序列,并成功构建了其真核表达载体。

摘要：[目的]建立一种诊断绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR方法,确定肺炎支原体感染的靶器官。[方法]根据GenBank网站上登录的绵羊支原体16S rRNA基因序列,设计并合成2对引物,以肺炎支原体菌株基因组DNA为模板,经过PCR反应条件的优化,通过测序验证扩增产物的正确性,建立了绵羊支原体肺炎病原的巢式PCR检测方法,进而应用建立的方法完成临床阳性病料肺脏、肺淋巴、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、皮肤、小肠和外周血检测以及疑似样本肺脏组织的检测。[结果]建立的巢式PCR方法可扩增出864 bp的特异性目的片段,肺脏和肺淋巴为绵羊肺炎支原体感染的靶器官,临床样本巢式PCR检出率与支原体培养鉴定结果的符合率为100%。[结论]建立的绵羊支原体肺炎病原巢式PCR检测方法可用于临床样本的实验室诊断。

摘要：成纤维细胞生长因子5(FGF5)是影响毛囊周期性活动及毛发生长的重要生长因子。本研究利用CRISPR/Cas9n系统靶向编辑绵羊成纤维细胞中FGF5基因。首先利用Gibson Assembly法将U6启动子引导表达单导向RNA(sgRNA)的原件构建至pX461质粒中,获得pX461-U6质粒;再将设计并合成好的1对靶向FGF5基因第3外显子的sgRNA及其互补链,经退火连接形成sgRNA-sg1和sgRNA-sg2双链后,分别克隆至带有BbsⅠ和BsaⅠ黏性末端的pX461-U6质粒。构建好的重组质粒pX461-U6-sg1+sg2经测序鉴定后,以电转染的方式转入绵羊成纤维细胞,72 h后收集细胞进行检测分析。经T7E1酶切检测分析表明,成功获得1对具有靶向效果的sgRNA,PCR扩增的FGF5基因片段经TA克隆后进行测序鉴定,结果sgRNA-sg1+sg2在靶位点的打靶效率为100%;缺失的核苷酸数从10到64个不等;基于预测的3D模型和RT-PCR结果显示,FGF5基因的突变将会影响FGF5蛋白与其受体的结合,导致FGF5蛋白失去其生物学功能。本研究构建了可以在同一载体中同时表达2条sgRNA和Cas9n以及绿色荧光蛋白(GFP)的质粒,瞬时转染至绵羊成纤维细胞后,成功获得了高效靶向绵羊FGF5基因的sgRNA位点,为精确和高效的靶向基因工程提供了科学依据。

摘要：为研究细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus,E.g)TSP8基因的分子特性以及其在虫体不同发育阶段的差异表达,根据NCBI GenBank数据库中的TSP8基因设计1对特异性引物,对TSP8基因进行PCR扩增,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后测序,通过生物信息学软件分析预测TSP8基因的结构与功能,并通过SYBR GreenⅠqRT-PCR方法分析TSP8基因在虫体原头蚴、包囊壁以及成虫mRNA相对转录情况。结果显示:成功克隆到细粒棘球绦虫TSP8基因序列,与细粒棘球绦虫跨膜蛋白(GenBank登录号:CDS17460.1)同源性为100%;进一步生物信息学分析显示,TSP8基因全长669个核苷酸,编码222个氨基酸,理论等电点为5.06,为稳定蛋白分子;TSP8基因编码的氨基酸序列共含有5个跨膜区域,含有4个优势B抗原表位;qRT-PCR结果显示TSP8基因在原头蚴及成虫阶段均有表达,差异显著,具有统计学意义(P<0.05)。本研究对细粒棘球绦虫TSP8基因的分子特性进行了初步研究,为进一步揭示其生物学功能奠定了基础。

摘要：通过慢病毒包装系统构建能稳定表达双荧光标记的微管相关蛋白轻链3(mCherry-GFP-LC3Ⅱ)的小鼠巨噬细胞系(RAW264.7),并探讨布鲁菌感染对自噬溶酶体途径的影响。设计并合成含mCherry-GFP-LC3Ⅱ基因的重组慢病毒表达质粒,将重组质粒与慢病毒包装质粒(pMD2.G和pspa×2.0)共同转染293T细胞,浓缩细胞上清中的病毒,用其感染RAW264.7小鼠巨噬细胞。经嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达mCherry-GFP-LC3Ⅱ的RAW246.7细胞株,用倒置荧光显微镜和流式细胞术分析感染效率。分别用Earle’s平衡盐缓冲液(Earle’s balanced salt solution,EBSS)和布鲁菌M5疫苗株菌株处理该细胞株,激光共聚焦显微镜下观察mCherry-GFP-LC3Ⅱ斑点。成功获得了稳定表达mCherry-GFP-LC3Ⅱ的RAW264.7细胞株,经嘌呤霉素筛选后荧光显微镜和流式细胞仪显示荧光阳性率达90%以上,EBSS和布鲁菌M5疫苗株菌株处理后自噬斑点显著增多。成功构建了能够稳定传代的mCherry-GFP-LC3Ⅱ-RAW264.7细胞株,为后续自噬相关研究建立了可靠的细胞平台。

摘要：目的建立一种安全、快速、高效的细粒棘球绦虫(Echinococcus granulosus)的诊断方法——环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。方法根据细粒棘球绦虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基2(cytochrome c oxidase subunit 2,cox2)基因序列,设计4条LAMP引物,建立LAMP检测方法,采用LAMP法和常规PCR法检测细粒棘球绦虫、泡状带绦虫(Cysticercus tenuicollis)、扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)、羊曲子宫绦虫(Thysaniezia ovilla)、中点无卵黄腺绦虫(Avitellina centripunctata)、鞭毛线虫(flagella nematodes)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、多房棘球绦虫(***)和捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)等9种寄生虫的DNA以验证LAMP法的特异性;分别用LAMP法和常规PCR法检测梯度稀释的含cox2基因片段的细粒棘球绦虫标准质粒后,比较两者的敏感性。采用LAMP、PCR和夹心ELISA法检测50份犬粪样,计算细粒棘球绦虫cox2基因的阳性率,评价所建立的LAMP法检测效果。结果LAMP法的特异性验证结果表明,仅在以细粒棘球绦虫DNA为模板的反应体系中出现特异性产物。LAMP法在细粒棘球绦虫标准质粒浓度为16.09 ag/μl时仍可见梯状条带,而常规PCR法仅可检测到浓度为16.9 fg/μl以上的质粒,LAMP法灵敏性是常规PCR法的1 000倍。对50份犬粪中细粒棘球绦虫DNA的检测结果显示,PCR、LAMP和夹心ELISA法检测结果相同,阳性率为8.0%(4/50)。结论基于细粒棘球绦虫线粒体cox2基因的LAMP检测方法操作方便、特异性较强、敏感性较高,适于细粒棘球绦虫感染犬的快速检测。

摘要：肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)可负调控骨骼肌的发育。本研究利用胞嘧啶碱基编辑器(cytidine base editor,CBE)在哈萨克羊MSTN基因编码区提前引入终止密码子,以期达到敲除MSTN基因的目的。共设计2条靶向哈萨克羊MSTN基因不同外显子的sgRNAs,分别连接至pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin质粒,并与pCMV-AncBE4 max-P2A-GFP质粒共转染哈萨克羊胎儿成纤维细胞,经CruiserTM酶酶切检测、Sanger测序和TA克隆分析。结果显示,成功筛选出可以在哈萨克羊MSTN基因外显子提前引入终止密码子的2条sgRNAs,其中STOPsg-1靶位点编辑效率为26.7%,STOPsg-2靶位点的编辑效率为6.7%。本研究成功运用CBE(AncBE4 max)技术在哈萨克羊胎儿成纤维细胞MSTN基因编码区实现定点编辑,为培育精确编辑MSTN基因的哈萨克羊奠定基础。

摘要：目的克隆细粒棘球绦虫发育相关基因Tetraspain 2-TSP2(TSP2),并对其进行生物学分析。方法通过在线检索WormBas ParaSite网站中Eg细粒棘球绦虫基因组数据库,获得TSP1的cDNA序列并设计特异性引物。提取细粒棘球绦虫原头蚴总RNA,以此模板,RT-PCR扩增TSP2基因,将PCR产物克隆到pMD19-T载体后进行测序,并进行生物信息学分析。通过SYBR Green I qRT-PCR方法分析TSP2基因在原头蚴、包囊壁以及成虫中mRNA的相对表达量。结果克隆的TSP2基因序列与WormBas ParaSite中已登录的细粒棘球绦虫跨膜蛋白EGR05083.1同源性为100%。TSP2基因cDNA全长621个核苷酸,编码206个氨基酸的TSP2蛋白,理论等电点为7.33,不稳定指数为47.50,为不稳定蛋白。脂肪系数为109.71,亲水性疏水性平均值为0.987,为疏水性可溶性蛋白。TSP2编码的蛋白含有4个跨膜区,4个优势B抗原表位,属于跨膜蛋白家族,该蛋白具有3个开放阅读框。qRT-PCR显示,TSP2基因在细粒棘球绦虫原头蚴、包囊壁及成虫中均有转录,转录水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论细粒棘球绦虫TSP2基因其编码蛋白含有优势B抗原表位,为包虫病重组免疫诊断抗原和亚单位疫苗的研发奠定了基础。