摘要：目的:比较现有的DNA制备方法,建立一种从甲醛固定石蜡包埋组织(formalin-fixed paraf-fin-embedded tissues,FFPET)提取高质量基因组DNA的方法。方法:将传统基因组DNA提取方法与市场供应的DNA亲和层析柱结合在一起,以水浴脱腊法替代二甲苯脱腊法,设计一种改良的基因组DNA快速提取方法,从石蜡包埋宫颈癌组织标本提取基因组DNA,并用琼脂糖凝胶电泳法和聚合酶链式反应法进行鉴定。结果:改良的基因组DNA提取法整合了水浴脱蜡与DNA亲和层析柱的优点,从石蜡包埋宫颈癌组织中获得了高质量的基因组DNA,特别是能以很高的效率回收大于20 kb的基因组DNA大片段。结论:改良的基因组DNA提取方法简单快捷,是一种从石蜡包埋组织中回收高质量基因组DNA的有效途径。

摘要：目的:研究组织因子抑制物2(TFPI-2)基因在维吾尔族妇女宫颈病变组织中的甲基化水平,探讨其甲基化水平变化与宫颈病变的关系。方法:收集维吾尔族妇女慢性宫颈炎、宫颈内瘤变(CIN、cervical intraepithelial neoplasia)Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ和宫颈鳞癌(cervical squamous cell carcinoma,CSCC)患者的新鲜组织标本,提取高质量基因组DNA和RNA,设计TFPI-2基因启动子区CpG岛片段特异性PCR引物及RT-PCR引物,应用Sequenom MassARRAY甲基化DNA定量分析平台和半定量RT-PCR技术,对维吾尔族妇女宫颈组织DNA进行甲基化水平定量分析。结果:分析Sequenom MassArray质谱数据,TFPI-2基因启动子区CpG岛片段(目的片段)甲基化水平定量差异显著(P<0.05)。分别对TFPI-2的单点CpG位点甲基化水平差异进行分析,可见TFPI-2基因的目的片段的CpG-1、CpG-6、CpG-7、CpG-8、CpG-9和CpG-11等六个CpG位点甲基化率在肿瘤与正常对照之间均有统计学差异(P<0.05)并且两个CpG位点相关性很密切(r<0.5、P<0.01);半定量RT-PCR鉴定结果表明,TFPI-2 mRNA表达水平在宫颈炎组增高,在CINⅠ/Ⅱ/Ⅲ组降低,而在宫颈鳞癌组最低,宫颈炎组与宫颈癌组比较,差异均有统计学意义(P<0.01),说明该基因转录表达水平下调伴随着宫颈病变进程。结论:维吾尔族宫颈癌细胞内的TFPI-2基因启动子区CpG岛高甲基化与该基因表达水平变化密切关联。在维吾尔族妇女宫颈病变进程中TFPI-2基因启动子高甲基化是其基因的转录水平(mRNA)下调的重要原因,可能是宫颈癌的早期预警指标,为该基因甲基化相关的表观遗传学研究提供了依据。

摘要：目的利用分子克隆技术构建36型腺病毒(Ad36)腺病毒基因早期转录区4可读框基因1(E4ORF1)重组原核表达质粒pET30a-E4ORF1,经诱导表达后,制备并纯化获得E4ORF1抗原,经免疫兔后获得多克隆抗体。方法根据NCBI数据库中人Ad36基因组全序列,设计引物、PCR扩增其中的E4ORF1基因全长并将其克隆至原核表达载体中、测序。将测序正确的原核表达质粒pET30a-E4ORF1转化至***21(DE3)菌株中,通过探索E4ORF1蛋白的最佳诱导条件后,对重组蛋白进行大量诱导表达和纯化。将纯化获得的重组蛋白免疫新西兰白兔,在5次免疫后分离血清,ELISA检测抗体效价。抗原亲和纯化出E4ORF1多克隆抗体,Western blot法检测抗体的特异性。结果成功扩增E4ORF1基因,经测序比对与GenBank序列一致,大小为408 bp,证明成功构建原核重组表达质粒。经鉴定重组蛋白的相对分子质量(M_(r))约14000,ELISA检测5次免疫后兔血清抗体效价达1∶320000。Western blot法证明该抗体具较高的特异性。结论成功表达E4ORF1蛋白,并制备了高特异性的兔抗E4ORF1多克隆抗体。

摘要：背景:骨形成蛋白2是骨基质中最重要骨生长因子,主要生物学作用是促进未分化的间充质细胞和骨系细胞的募集和分化,是骨生成的启动因子,可以作为骨修复基因治疗的理想目的基因。目的:使用前期已经构建成功的pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞。设计、时间及地点:细胞学观察实验,于2007-12/2008-06在新疆医科大学自治区地方病分子生物学实验室完成。材料:良种新西兰大白兔由新疆医科大学动物试验中心提供,pIRES2-EGFP-BMP-2由本校分子生物学实验室构建、保存。方法:采用贴壁法及密度梯度离心法提取骨髓间充质干细胞。采用脂质体介导转染法将pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒转染兔骨髓间充质干细胞。主要观察指标:通过荧光显微镜、反转录聚合酶链式反应、免疫组织化学及Western免疫印迹检测其转录、表达活性。结果:转染的兔骨髓间充质干细胞细胞可见绿色荧光蛋白的持续表达,绿色荧光蛋白分布于整个细胞,呈胞浆分布,说明重组载体构建成功并能在体细胞中表达。转染pIRES2-EGFP-BMP-2的兔骨髓间充质干细胞经G418抗性筛选并传代、培养4周后,RT-PCR反应可扩增出112kb条带,大小与预期相符合。Western免疫印迹检测显示,经pIRES2-EGFP-BMP-2转染的兔骨髓间充质干细胞经在相对分子质量为30×103处显现单一特异性条带,表明为骨形成蛋白2基因表达产物。免疫组织化学显示,转染pIRES2-EGFP-BMP-2后经G418抗性筛选并传代、培养4周后的兔骨髓间充质干细胞细胞质中有棕黄色颗粒阳性信号。结论:用pIRES2-EGFP-BMP-2真核表达质粒成功转染兔骨髓间充质干细胞并获得表达。

摘要：目的：通过新的维吾尔族妇女宫颈癌组织特异性上调表达基因的分析，探讨宫颈癌发生与基因表达调控的关系及临床意义。方法选择6种新发现的宫颈癌组织特异性上调表达候选基因，设计 mRNA 特异性引物，对25例宫颈鳞癌（cervical squamous cell carcinoma，CSCC）、22例宫颈内上皮瘤变（cervical intraepithelial neo-plasia，CIN）Ⅱ～Ⅲ和25例宫颈炎组织 RNA 进行半定量 RT-PCR 鉴定。结果 CSCC 与宫颈炎组织比较， SHISA2、SIX1、果蝇同源盒基因（DTL）、桥粒芯糖蛋白-2（DSG2）、NUP62CL 和胞嘧啶脱氨酶（APOBE63B）6种基因的 mRNA 水平均有差异（P ＜0．05）；CSCC 与 CINⅡ～Ⅲ比较，SHISA2、SIX1、APOBEC3B 和 DSG24种基因的mRNA 水平有差异（P ＜0．05），而 CINⅡ～Ⅲ与宫颈炎比较，只有 SHISA2基因的 mRNA 水平差异有统计学意义（P ＜0．05）。结论SHISA2、SIX1、DTL、DSG2、NUP62CL 和 APOBE63B 6种基因的转录表达水平变化可能成为维吾尔族妇女宫颈癌发生的早期预警标志物。

摘要：目的构建携带Human Hsa-mir-133b基因的miRNA干扰慢病毒载体(pl KD-Ubc-e GFP-U6-shRNA),并成功转染食管癌Eca109细胞株。为研究微小RNA133b(miR-133b)对食管癌Eca109细胞的作用奠定基础。方法凭据Human Hsa-miR-133b基因的转录目录,设计shRNA的靶点并进行引物的合成。将单链的引物退火成带粘性末端的双链片段,将其衔接于双酶切的RNA干扰载体,替换原有的ccd B毒性基因,用重组的质粒转染感受态细胞,并测定序列。筛选出来的阳性克隆即为miR-133b的干扰载体质粒。提取测序结果准确的克隆里含有的载体质粒。将重组的载体质粒转染至食管癌Eca109细胞。结果成功构建了miR-133b干扰慢病毒载体,重组质粒进行PCR鉴定及序列测定证实DNA oligo成功连到载体中,并实现食管癌ECA109细胞中重组载体质粒的稳定转染。在荧光倒置显微镜下分别观察到重组空载体组转染的Eca109细胞和过表达载体组转染的Eca109细胞发出不同强度的带有绿色荧光的信号。结论该实验成功构建了人miR-133b基因的干扰慢病毒载体,采取脂质体法对食管癌Eca109细胞进行质粒转染,获得高表达,为进一步研究miR-133b的功能奠定牢固的基础。

摘要：分子生物学是生命科学的带头学科,其理论与实验技术已广泛地渗透到生命科学的各个领域,在医学基础理论和临床应用中正显示出日益重要的意义.为此学习和掌握分子生物学基本技术已成为从事和即将从事生命科学工作者的迫切需要与愿望.2002年生物化学暨分子生物学教研室对本科实验教学进行了大幅度的改革,除保留了8学时的生物化学实验内容外,增添了28学时的新近发展起来的分子生物学新技术,其中组织DNA提取纯化与鉴定技术就是一个既具备综合性,又能够为学生创造一个设计思路的大实验.通过两年的运转,不断地对其技术进行优化,对实验条件进行质控,使这项新技术不断完善、稳定,为实验教学提供了一个较高的技术平台.