摘要：目的构建趋化因子受体(CXCR4)小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,研究其对体外乳腺癌细胞侵袭能力的影响。方法选择CXCR4高表达的乳腺癌MDA-MB-231细胞系,设计合成人CXCR4基因不同靶点的能编码siRNA的2条双链DNA序列,克隆到真核表达载体pGE-1-U6/kna中构建siRNA表达载体,体外脂质体介导转染MDA-MB-231细胞,用Western blot分析CXCR4蛋白表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力。结果成功构建了CXCR4-siRNA表达载体,瞬时转染乳腺癌细胞后能显著降低CXCR4的蛋白表达,可有效抑制人类乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭能力。结论CXCR4-siRNA表达载体通过降低CXCR4基因的蛋白表达能显著抑制人类乳腺癌细胞的侵袭能力,有望为乳腺癌转移的基因治疗开辟新途径。

摘要：背景:碱性成纤维细胞生长因子对于创伤修复具有明显的促进作用,但局部应用难以持久地发挥作用。目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞后的表达情况。设计、时间及地点:细胞基因学体外观察,于2009-03/08在云南大学生命科学院完成。材料:日本大耳白兔1只,购于昆明医学院动物科。pCDNA3.1质粒为美国Invitrogen产品。方法:抽取兔髂前上棘骨髓,采用贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,待细胞融合至培养瓶底80%时消化传代。参考GeneBank碱性成纤维细胞生长因子cDNA序列设计合成基因,电泳纯化后xholⅠ、BamHⅠ双酶切回收凝胶,以限制性核酸内切酶对PcDNA Vector质粒进行酶切、电泳和凝胶回收,连接碱性成纤维细胞生长因子DNA与PcDNA Vector质粒,构建pCDNA-碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体,运用脂质体转染法将重组体转染至兔骨髓间充质干细胞中,并筛选稳定转染株。主要观察指标:骨髓间充质干细胞表面抗原的表达,Western blot法检测目的蛋白的表达。结果:流式细胞仪检测结果示所培养细胞表面抗原呈CD90,CD44阳性,CD45呈阴性;免疫组化检测结果示骨髓间充质干细胞血管源性细胞表面抗原CD34呈阴性,而相对特异性标记物CD44呈阳性。转染碱性成纤维细胞生长因子的骨髓间充质干细胞提取的细胞裂解液中,在Mr23000处有一条明显阳性杂交带;而转染pCDNA3.1(-)空载体的骨髓间充质干细胞提取蛋白未见阳性条带。结论:实验成功地将碱性成纤维细胞生长因子基因转染至兔骨髓间充质干细胞,该目的基因可稳定表达。

摘要：目的研究转染Livin反义寡核苷酸（antisense 01igodeoxynucleotide，ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞LivinmRNA及Livin蛋白表达以及细胞增殖的影响。方法设计合成全硫代磷酸化修饰并5’端FITC荧光标记的LivinASODN。用脂质体介导Livin ASODN转染QBC939细胞，荧光显微镜观察24 h Livin ASODN转染入细胞的情况，并计算转染率。MTT法检测I Lvin反义寡核苷酸对QBC939细胞增殖的抑制作用。RT-PCR和细胞免疫荧光化学分别检测转染后48 h Livin mRNA表达及Livin蛋白的变化。结果500mol／LASODN转染后24h可达到最佳的转染效果；转染后60h，能明显抑制胆管癌细胞的增殖。转染60h后，RT—PCR及细胞免疫荧光化学检测分别显示Livin mRNA及Livin蛋白表达水平明显低于对照组（P〈0．05）。结论脂质体介导转染Livin ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的Livin基因及Livin蛋白表达，抑制胆管癌QBC939细胞的增殖，降低癌细胞活力。

摘要：背景:脑源性神经营养因子对多种神经元的发育、存活及轴突再生中起着重要作用,但由于血脑屏障的存在,限制了其应用。目的:构建大鼠脑源性神经营养因子基因重组真核表达载体,观察其在真核细胞内的表达。设计、时间及地点:单一样本实验,于2005-09/2006-09在昆明医学院神经科学研究所完成。材料:清洁级健康雄性8周龄SD大鼠,体质量250g。方法:①以反转录-聚合酶链反应从大鼠脑组织总RNA扩增脑源性神经营养因子基因编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,构建重组表达载体pcDNA3/BDNF。②将L939细胞分为pcDNA3/BDNF转染组、pcDNA3转染组和未转染组,以FuGene HD转染试剂介导相应质粒转染。主要观察指标:①重组质粒pcDNA3/BDNF的酶切鉴定与序列分析。②免疫细胞化学和western blot鉴定脑源性神经营养因子在L929细胞中的表达。结果:①重组质粒pcDNA3/BDNF经酶切产生783bp和5.2kb的片段,DNA测序证实783bp片段的碱基序列与大鼠脑源性神经营养因子基因编码序列完全一致。②基因转染后,免疫细胞化学、western blot结果表明脑源性神经营养因子能在真核细胞中正确表达。结论:成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3/BDNF,为后续研究奠定了基础。