摘要：目的建立可调控大鼠局部脑区CNN3基因表达的技术,为进一步研究CNN3基因参与脑内病理生理过程奠定基础。方法设计并合成针对CNN3基因的全长编码序列c DNA和3条sh RNA干扰靶点序列,利用基因工程技术构建CNN3-OE和3个CNN3-sh RNA慢病毒载体,在立体定位仪引导下注入大鼠海马,采用蛋白免疫印迹技术筛选CNN3基因的最佳沉默序列,并找出重组表达和沉默慢病毒载体调控海马CNN3基因的变化规律。结果CNN3-OE和3个CNN3-sh RNA慢病毒干扰载体均构建成功,转染后8周内对海马CNN3基因水平均有一定调控作用,其中CNN3-sh RNA2载体组在转染后的8周内海马CNN3基因编码蛋白calponin-3水平均显著性下调,最高抑制率为73.26%;CNN3-OE慢病毒载体组中海马calponin-3蛋白水平具有统计学意义的升高仅在转染后第14天,上调率为93.88%。结论通过定位注射CNN3-OE和CNN3-sh RNA慢病毒载体可在体调控局部脑区CNN3基因表达,为后续的机制研究和开拓疾病防治新途径奠定基础。

摘要：人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染的长期不进展者(LTNP)体内分离到的广谱中和抗体(bNAbs),已被证明可以预防HIV-1感染并降低感染者体内的病毒载量,成为了指导HIV-1疫苗设计和被动免疫治疗的突破口。中和抗体的功能除了与靶向表位有关,其亲和力也极大的影响了抗体的活性。HIV-1 bNAbs通过体内的多轮亲和力成熟获得了较高亲和力,从而实现了广谱度和中和活性的增加。高亲和力HIV-1 bNAbs在治疗过程中能更好的协助机体免疫系统清除病原体,并且使用剂量更少,毒副作用也相对较低。在亲和力成熟的同时,HIV-1 bNAbs表现出了高水平的体细胞超突变(SHM)、插入缺失、较长的重链第三互补决定区等不寻常的特征。这些特征阻碍了通过有效疫苗诱导HIV-1 bNAbs在体内产生并发育成熟,因此了解抗体亲和力成熟过程中发生的突变及其要点,有助于理解中和抗体的活性与特征的关系,并为设计有效的HIV-1潜在免疫原提供参考。

摘要：目的预测并验证HOX转录反义RNA(HOTAIR)通过上调miR-152-3p对人类白细胞抗原-G(HLA-G)靶向调控作用。方法利用生物信息学网站及软件预测miR-152-3p与HOTAIR和HLA-G基因3′非翻译区(UTR)的结合位点,设计合成含有与miR-152-3p结合位点的HOTAIR和HLA-G基因3′-UTR序列及其突变序列,并构建HOTAIR和HLA-G野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体。经双酶切电泳和测序鉴定后,HOTAIR和HLA-G野生型与突变型双荧光素酶报告基因载体分别与miR-152-3p模拟物(mimics)和miRNA无义序列阴性对照(mimicsNC)共转染HTR-8/SVneo细胞,检测荧光素酶活性,观察miR-152-3p对HOTAIR和HLA-G表达的影响。结果双酶切电泳和测序结果显示,野生型和突变型的HOTAIR和HLA-G基因载体片段大小、序列与实验预期一致,载体构建成功。转染miR-152-3pmimics后的HOTAIR及HLA-G野生型荧光素酶活性显著降低(P0.05)。结论HOTAIR通过上调miRNA-152-3p靶向调控HLA-G。

摘要：目的应用小干扰RNA(siRNA)技术抑制产肠毒素大肠杆菌(ETEC)LT基因的表达。方法针对LT基因设计siRNAs序列,在ETEC培养过程中,将针对LT的siRNA、非特异性对照siRNA、阴性对照siRNA和LB培养基分别加入siRNA组(siRNA-LT1组、siRNA-LT2组)、siRNA-coa3组、siRNA-NC组和空白对照组,分3个时间点加入,每次1nmol。在首次加入siRNA后45min(A时间点)、90min(B时间点)、135min(C时间点)留取菌液,应用实时荧光定量PCR检测上述3个时间点5组LT mRNA的表达水平。应用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测siRNA-LT1组、siRNA-LT2组和空白对照组在3个时间点的LT蛋白表达水平。结果实时荧光定量PCR结果显示,siRNA-LT1在A、B、C 3个时间点对LT mRNA表达的抑制率分别为70.9%、70.1%、72.5%,siRNA-LT2在A、B、C 3个时间点对LT mRNA表达的抑制率分别为70.1%、69.2%、70.5%,siRNALT1组、siRNA-LT2组对LT mRNA表达的抑制率与相应处理时间的siRNA-NC组、siRNA-coa3组、空白对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示,siRNA-LT1和siRNA-LT2在A、B、C 3个时间点对LT蛋白表达的抑制率分别为43.1%、18.4%、5.0%和38.2%、15.4%、30.1%。结论针对LT基因设计合成的siRNA在体外能有效地抑制LT基因的表达。

摘要：目的探讨siRNA能否抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)主动外排系统oprM基因的表达。方法针对oprM基因序列设计合成3对siRNA片段,分别转化耐药PA,采用抗菌素药物敏感试验筛选出能抑制PA耐药的siRNA片段及其最佳转化剂量,再构建siRNA质粒表达载体,转化PA标准菌株,应用western blot技术检测OprM蛋白表达量的变化。结果筛选出一对能抑制PA耐药的siRNA片段,确定其最佳转化剂量为25μL(20μm/L)/100μL PA菌液。成功构建了靶向oprM基因的siRNA质粒表达载体。Western Blot检测结果显示,转化siRNA质粒载体的PA其OprM蛋白的表达量明显降低。结论靶向oprM基因的siRNA能够抑制PA oprM基因的表达。

摘要：目的建立一种快速、准确、特异的定量检测ACACB基因rs2268388多态性的方法.方法针对ACACB基因序列设计引物和Taqman探针,探索实时荧光定量PCR技术检测ACACB基因rs2268388多态性的最佳条件,设立不同浓度,并检测其灵敏度和特异性.结果 PCR反应预变性时间为10 min,退火、延伸时间为1min时扩增产物效果理想.Taqman实时荧光定量PCR探针及引物浓度0.5μL(0.2μM),Taq Man Genotyping Master Mix 5μL,d H_2O 2.5μL总体系为10μL时扩增产物效果理想并节约了实验费用,检测特异性良好.结论优化Taqman探针法的实验条件能够灵敏、特异、稳定地对ACACB基因rs2268388多态性进行定量检测,并有效节约了实验成本.

摘要：目的构建人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒,并进行自激活检测。方法根据GenBank中登录的GINS2基因编码区序列(NM016095)设计引物,以pCDNA3.1-GINS2质粒为模板进行PCR扩增,将PCR产物克隆至诱饵载体pGBKT7上,构建诱饵质粒pGBKT7-GINS2。将鉴定正确的诱饵质粒及对照质粒共同转化至酵母细胞AH109中培养,Western blot法检测诱饵蛋白GINS2的表达,随机挑取6个菌落,进行His3、Ade2及LacZ报告基因的自激活效应检测。结果经双酶切及测序鉴定证明诱饵质粒pGBKT7-GINS2构建正确。诱饵蛋白GINS2相对分子质量为21000,可在AH109酵母细胞中稳定表达。诱饵质粒转化的酵母细胞在SD/-Trp/-Leu缺陷平板生长,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade缺陷平板上不生长,表明报告基因His、Ade2未被激活,报告基因LacZ检测结果与阴性对照相同,表明诱饵蛋白GINS2不存在自激活。结论成功构建了人GINS2基因酵母双杂交诱饵质粒,其表达蛋白对酵母AH109细胞无毒性,也无自激活现象,可用于后续蛋白筛选试验。

摘要：目的利用逆转录环介导恒温扩增技术建立新型冠状病毒核酸快速检测方法。方法针对新型冠状病毒的特征核壳蛋白N基因和开放阅读框1ab(ORF1ab)基因序列保守区设计引物,获得了RT-LAMP检测体系,并评价该体系的特异性、最低检测限、抗干扰能力和最佳反应时间。结果经检测新型冠状病毒核酸标准物质,其结果与预期相符,证实了该检测体系的可行性。结论利用逆转录环介导恒温扩增技术快速检测新型冠状病毒核酸的反应体系特异性好、灵敏度高,适用于边境条件有限地区。

摘要：目的在我国开展多中心的过敏性疾病患者对猫狗马皮屑的致敏分布特征调查, 为诊治与预防过敏性疾病提供常见动物过敏原的流行病学数据。方法采用流行病学调查研究设计, 依托于由广州医科大学附属第一医院牵头开展的全国过敏性疾病流行病学调查项目, 于2021年1至12月在广州医科大学附属第一医院等14家单位的呼吸科、儿科及变态反应科门诊中共纳入2 122例诊断为过敏性疾病患者, 同期从上述单位体检中心纳入222例健康受试者作为对照。所有纳入的受试者在医生指导下进行填写过敏性疾病调查问卷, 并采用磁微粒化学发光系统检测所有受试者的猫狗马过敏原特异性免疫球蛋白E(sIgE)。分析3种动物过敏原在不同疾病、不同年龄和不同地区之间的流行病学特征。使用χ2检验分析组间频率差异, 采用t检验或Mann-WhitneyU检验两组间的分布差异, 以及采用单因素方差(ANOVA)分析或Kruskal-WallisH检验比较多组间的分布差异。并绘制条形图、韦恩图和雷达图展示致敏分布特征。因受试者漏填而产生的极少数缺失值在分析过程中已被剔除。结果 2 122例过敏性疾病患者中男性占57.35%(1 217/2 122), 女性占40.95%(869/2 122), 存在1.70%(36/2 122)例患者的性别信息缺失。过敏性疾病患者的年龄为9.0(6.0, 28.0)岁, 而健康对照组的年龄为29.0(13.0, 39.0)岁, 并分别存在1.7%(36/2 122)和0.9%(2/222)例受试者的年龄信息缺失。过敏患者组剖腹产的比例明显高于健康对照组(31.4%vs. 17.6%, χ2=16.582, P<0.001)[患者组和对照组分别存在2.5%(54/2 122)和5.4%(12/222)例样本的出生方式信息缺失]。过敏性疾病患者报告父母双方均患过敏性疾病的比例显著高于对照组(35.7%vs. 9.5%, χ2=65.171, P<0.001)。总体上16.4%的过敏性疾病患者对猫皮屑致敏, 10%和6%对狗和马皮屑致敏。猫皮屑在鼻炎、哮喘、结膜炎、食物过敏和特应性皮炎患者人群中的致敏率最高, 为16.4%~21.6%, 狗皮屑次之, 为10.2%~15.2%。不同的动物致敏人群中, 均以过敏性鼻炎的患病率最高。猫狗马过敏原同时致敏的比例在10%~15%之间, 任意两种或以上动物皮屑同时致敏的比例约为45%。动物过敏原与呼吸道过敏性疾病相关, 尤以过敏性鼻炎合并过敏性结膜炎最常见。不同地区3种动物过敏原致敏率分布存在明显差异, 全国各省份中均以猫皮屑的致敏率最高。结论动物皮屑过敏原的致敏率显著上升, 并以儿童和青少年最高。猫皮屑是最常见的动物源性过敏原, 其次为狗。不同的动物之间由于其高度的同源性而表现出明显的交叉或共同致敏。