摘要：【目的】利用CRISPR/Cas9技术敲除猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)的过氧化物酶体增殖激活受体γ(PPARγ)基因,进而在细胞水平上研究PPARγ基因与肠道炎症反应相关的生物学机制。【方法】根据猪PPARγ基因序列(GenBank登录号:NM_214379),在第2外显子区域设计2对sgRNA序列,经退火形成DNA双链后连接至真核表达载体gRNA_GFP-T1;将构建成功的PPARγ正向打靶载体、反向打靶载体、Cas9-nickase质粒共转染至IPEC-J2细胞,经G418药物筛选获得单克隆细胞株,提取单克隆细胞株DNA后进行PCR扩增,经凝胶电泳鉴定后送测序;挑选基因敲除效果最佳的细胞株,利用免疫荧光法检测PPARγ蛋白表达情况。【结果】打靶载体测序结果显示,打靶序列正确连接;经转染、筛选后共获得48株单克隆细胞;测序结果显示,6株单克隆细胞出现双峰,分别为KO-15、KO-17、KO-21、KO-25、KO-32和KO-35;选择底峰较高的KO-25进行免疫荧光检测,结果显示PPARγ蛋白表达降低。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术成功获得了PPARγ基因敲除的IPEC-J2细胞,为后续进一步研究PPARγ基因在炎症反应中的功能奠定了基础。

摘要：为了建立牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)巢式RT-PCR方法,试验通过对我国近5年流行的BVDV毒株的全基因序列进行比对分析,选择BVDV的保守5′端非编码区(5′UTR)片段作为靶点,设计巢式RT-PCR引物,对内外套引物进行筛选,优化反应条件,并分析建立的巢式RT-PCR方法的敏感性和特异性,同时利用该方法对172份临床样品进行检测并与实时荧光定量PCR方法进行比较。结果表明:巢式RT-PCR方法的敏感性为1.8×10^(1)copies/μL,敏感性是仅使用一对引物进行一轮PCR扩增的100倍;该方法对BVDV具有较好的特异性,与水疱性口炎病毒(VSV)、猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)及蓝舌病病毒(BTV)均无交叉反应。从172份临床样品中共检出27份BVDV阳性样品,阳性率为15.70%,与实时荧光定量RT-PCR方法比较,符合率为81.82%。说明试验建立的BVDV巢式RT-PCR方法特异性、敏感性较好,可作为基层检测机构中诊断BVD的辅助检测方法。

摘要：【目的】建立特异针对牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)的实时荧光定量RT-PCR检测方法。【方法】通过比对分析近5年流行的BVDV-1毒株全基因序列,基于保守序列5′-UTR设计特异性引物和探针,优化反应体系和反应条件,并进行特异性、敏感性、重复性及临床样品检测试验。【结果】BVDV-1检测的最佳探针浓度为0.25μmol/L,引物浓度为0.60μmol/L,对阳性质粒标准品的最低检测限为1.7 copies/μL。特异性试验显示:建立的方法仅能特异性扩增BVDV-1,对蓝舌病、口蹄疫、水泡性口炎、小反刍兽疫和猪瘟等病毒不发生交叉反应,特异性良好,变异系数小于1%。采用建立的方法对172份临床血液样本进行BVDV核酸检测,结果检出BVDV阳性样本33份,阳性率为19.19%,与《牛病毒性腹泻/粘膜病诊断技术规范》(GB/T 18637—2018)中实时荧光定量RT-PCR检测结果一致。【结论】本研究建立的BVDV基因1型实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可用于临床样本的检测,为BVDV-1的检测及监测提供了有力的技术手段。

摘要：建立快速特异的小反刍兽疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法,用于小反刍兽疫的初步筛查.选用国标GB/T 27982-2011小反刍兽疫诊断技术中根据PPRV N基因设计的特异性引物探针,建立TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法.该检测方法具有良好的特异性,与蓝舌病、口蹄疫、山羊痘、羊口疮等常见牛羊病毒均无交叉反应.标准曲线线性相关系数为R^(2)=0.9828,最低检测限为6.8 copies·μL^(-1),组内变异系数均低于2%,组间变异系数均低4%.结果表明,本研究建立的实时荧光定量RT-PCR方法具有良好的特异性、较高的敏感性和稳定性.

摘要：为建立云南山茶(Camellia reticulata Lindl.)TaqMan探针实时荧光PCR鉴定方法,根据GenBank数据库中及本实验室所测的15条云南山茶ITS可变序列片段设计特异引物和相应的TaqMan探针.试验结果证明,该引物探针组合可对云南山茶"大理茶""蒲门茶""凤山茶""麻叶银红""泽河"5个品系分别进行特异性检测鉴定,而对山茶属华东山茶(Camellia japonica L.)、金花茶(Camellia petelotii(Merrill)Sealy)、普洱茶(Camellia sinensis ***(***)Kitamura)以及非山茶属的番茄均未检出荧光信号.本研究建立的云南山茶TaqMan探针实时荧光PCR快速鉴定方法特异性强、敏感性高、重复性好,非常适合基层和口岸在物种资源查验工作中推广应用,解决对云南山茶实施口岸查验的关键技术问题,提高查验效率.

摘要：利用CRISPR/Cas9系统构建猪的低密度脂蛋白受体基因LDLR敲除细胞:根据NCBI数据库猪LDLR基因(Gene ID为396801)序列设计sg RNA靶位点,构建敲除打靶载体,通过电转染猪胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得细胞克隆,进行PCR扩增和T载体克隆测序,经序列比对计算基因敲除效率。结果表明,依照CRISPR/Cas9系统GN20GG法则,在LDLR基因第一外显子上设计1条sg RNA,测序结果显示靶序列已正确连接,转染、筛选后共获得30个单细胞克隆,23个测序成功,其中有7个细胞克隆为LDLR基因敲除细胞克隆,敲除效率为30.4%。

摘要：《兽医公共卫生学》是动物医学专业的核心课程之一。为了提高教学质量,提升学生的学习兴趣,适应新型兽医人才培养要求。以《兽医公共卫生学》课程为例,对云南农业大学2届学生进行案例教学的实践与探索。结果表明,案例教学能显著地提高期末卷面成绩,学生对案例教学满意度较高,案例式教学能激发学生学习兴趣、增强学生现场认知感,提高学生综合能力,有利于提升《兽医公共卫生学》教学效果,为课程案例库建设提供依据。

摘要：全面推进课程思政建设,发挥专业课程立德树人的作用,专业课程应与思想政治课程同向同行,发挥协同育人效应。专业课程中深入发掘思政元素,是课程思政建设的重要内容,以动物医学专业“兽医公共卫生学”课程为例,对思政元素挖掘、课程教学融合、思政教学效果评价等进行了探索和实践,为农学专业课程中发掘思政元素提供参考。

摘要：为快速、灵敏、准确检测猫传染性腹膜炎病毒(feline infectious peritonitis virus,FIPV),以FIPV N基因为靶序列设计合成特异性引物及TaqMan探针,建立了一种FIPV实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行了试验。结果表明:该方法灵敏度高,最低检测限为3.4 copies/μL;特异性强,与狂犬病毒、猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫细小病毒、犬流感病毒、犬瘟热病毒等均无交叉反应;重复性好,批内变异系数为0.99%~4.13%,批间变异系数为1.29%~4.64%。以上结果说明,本试验建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法特异、敏感、重复性好,适用于FIPV的快速检测。

摘要：目的建立野生食用菌中白牛肝菌(Boletus bainiugan Dentinger)成分的荧光PCR检测方法。方法根据白牛肝菌的内源转录间隔区(internally transcribed spacer,ITS)基因序列设计白牛肝菌物种的特异性引物和探针,对样品中的靶标基因片段进行检测,并进行物种特异性检测、稳定性检测、灵敏度检测和实际应用检测。结果通过对供试的24种食用菌、动、植物材料进行检测,只有白牛肝菌出现特异性扩增,说明方法具有物种特异性;方法对白牛肝菌成分的检测灵敏度为1×10^-4 ng/μL白牛肝菌DNA或0.1%(m/m)白牛肝菌粉。结论该方法简单、灵敏、快速、准确,能应用于野生食用菌和食品中白牛肝菌的成分检测。