摘要：目的:设计并筛选能有效抑制人肝癌SMMC-7721细胞、人结肠癌Caco2细胞、人胃癌SCG-7901细胞增殖的增殖细胞核抗原(PCNA)siRNA。方法:总结以往提出的siRNA设计原则的基础上,设计4条PCNAsiRNA,体外转录合成PCNAsiRNA;并作用于3种肿瘤细胞,WST-8法检测细胞增殖活性,筛选能有效抑制肿瘤细胞增殖的siRNA序列;RT-PCR检测细胞PCNA mRNA水平;免疫细胞化学方法检测PCNA蛋白表达水平。结果:4条PCNA siRNA中,有3条序列(No.2、No.4、No.3)的siRNA能有效抑制3种肿瘤细胞的增殖;其中No.2、No.4作用效果最优,以50 nmol/L浓度作用48 h,对3种肿瘤细胞的增殖抑制率均可达到62%以上,No.2、No.4 PCNAsiRNA均能在mRNA和蛋白水平显著下调PCNA的表达。结论:PCNA siRNA能在体外有效抑制SMMC-7721细胞、Caco2细胞、SCG-7901细胞的增殖,其适宜作用浓度为50 nmol/L,适宜作用时间为48 h。

摘要：目的比较靶向Bcr/abl基因b3a2融合位点的小干扰RNA(small interferon RNA,SiRNA)及作用靶点完全相同的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)对人白血病K562细胞的增殖抑制作用,并联用三氧化二砷(AS2O3),比较二者对K562细胞化疗增敏作用。方法体外转录方法合成Bcr/ablb3a2融合位点SiRNA,lipofectamineTM2000转染,改良MTT法检测药物对K562细胞增殖的抑制作用。结果SiRNA和相同作用靶点的A-SODN均显示出明显的细胞增殖抑制效应,SiRNA抑制K562细胞的IC50为97.47 nmol/L,ASODN抑制K562细胞的IC50为10.71μmol/L;50 nmol/L SiRNA与AS2O3联用后,明显提高K562细胞对AS2O3的敏感性,相同浓度的ASODN对细胞无明显化疗增敏作用。结论本实验结果提示针对Bcr/abl基因融合位点设计的极低浓度的SiRNA即能显著抑制K562细胞增殖,提高细胞对化疗药物的敏感性,其效果明显强于同靶位点的ASODN,显示了RNAi技术应用于慢性髓系白血病的良好前景。

摘要：　目的:根据CpG寡脱氧核苷酸(CpGODN)的设计原则,设计和筛选对新生儿脐血单个核细胞免疫刺激作用较强的CpGODN;从中探求CpGODN的结构与免疫刺激活性之间的关系。方法:根据目前有关CpGODN免疫刺激活性的研究资料,设计合成15条不同结构特点的硫代及非硫代修饰的CpGODN,MTT法检测CpGODN对脐血中单个核细胞的刺激作用,分别筛选出作用较强的CpGODN,然后以CpG2006和T8为阳性对照,无关序列CpG17为阴性对照,再次比较这些CpGODN对单个核细胞的刺激增殖作用。结果:设计的2条CpGODN吸光度A值(CpG1:0 280±0 0612;CpG6:0 277±0 0562)高于T8(0 241±0 0438),而与CpG2006(0 283±0 0794)相当。结论:用MTT法筛选出了2条对新生儿免疫作用较强的CpGODN;CpGODN的结构与其免疫活性密切相关,这些关系特点利于指导CpGODN的设计。

摘要：背景:CpG寡核苷酸是一种高效低毒的免疫佐剂,在许多疾病的基因治疗中具有广阔的应用价值,但存在种属和细胞特异性,细胞摄取率低,易被酶降解,成为临床应用的障碍。目的:拟验证CpG寡核苷酸通过CD40配体-受体载体系统对脐血B淋巴细胞特异靶向传递及其免疫效应的增强作用。设计、时间及地点:观察对比实验,于2004-04/2007-10在广州暨南大学附属第一医院血液科、儿科完成。材料:取健康新生儿的肝素抗凝新鲜脐血,事先征得父母知情同意并获医院伦理委员会审核批准。方法:制备CD40配体-碳二亚胺-多聚左旋赖氨酸-CpG寡核苷酸交联复合物,与脐血单个核细胞共培养。分别于24,48,72,96h应用流式细胞仪检测单个核细胞对FAM标记CpG寡核苷酸的摄取率及平均摄入强度;培养96h后用直接免疫荧光标记法标记CD19,CD20,CD22单抗,以流式细胞仪检测阳性表达率;细胞悬液加入96孔板,3组分别加入CD40配体-碳二亚胺-多聚左旋赖氨酸-CpG寡核苷酸、单纯CpG寡核苷酸及ddH2O,培养92h,以四甲基偶氮唑盐比色法测细胞增殖能力;以酶联免疫吸附法测以上3组细胞培养上清IgG水平。主要观察指标:单个核细胞对CpG寡核苷酸的摄取率及平均摄入强度,淋巴细胞亚群的表达,细胞增殖能力,培养上清IgG水平。结果:与单纯CpG寡核苷酸未交联组相比,单个核细胞对交联复合物摄取率更高(>98%),达摄取峰值时间更早。共培养后CD19+,CD22+,CD20+细胞表达升高,细胞增殖量及上清IgG水平均高于对照组(P<0.05)。结论:CD40配体-受体载体系统有助于CpG寡核苷酸特异高效的B细胞靶向投递,并增强其免疫效应。

摘要：目的　建立一个简便快速方法 ,用于诊断家族性载脂蛋白B 10 0缺陷症R35 0 0W。方法　设计一对寡核苷酸引物 ,其上游引物为突变引物。以PCR扩增目的DNA顺序 ,产物用限制酶Nco1酸解 ,酶解体系中加入含Nco1切口的DNA片段作内参照物 ,以排除酶切时假阴性的出现。结果　所设计引物能成功地用于PCR以扩增目的DNA片段 ,长 14 4碱基对。产物与限制酶Nco1保温 ,正常基因产物不被切割 ,突变基因产物则由于引入一个人工限制酶切口而被切割 ,产生 117碱基对的片段 ,这两长度不同的片段可被 2 %琼脂糖凝胶电泳所分离。利用这一方法 ,于 16 2例高血浆胆固醇患者中检出两例杂合R35 0 0W突变基因携带者。结论　本突变引物PCR法成功地检出ApoB 10 0R35 0 0W突变基因 ,方法可靠 。

摘要：为了探讨抑制增殖细胞核抗原(PCNA)基因表达对人肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响,将前期筛选出的最佳siRNA序列转化为能表达其小发夹结构RNA(smallhairpinRNAs,shRNA)的DNA序列,并与pSilencer2.0-U6质粒定向连接,构建靶向PCNA基因的siRNA真核表达载体pShPCNA,经DNA测序证实与设计完全一致.随后采用WST法及克隆形成抑制观察细胞增殖抑制情况、划痕实验来观察细胞迁移能力,流式细胞术、Hoechest33258染色、细胞线粒体膜电位改变检测细胞凋亡.在转染HepG2细胞48h后,pShPCNA组细胞PCNAmRNA表达明显下调,并出现明显的增殖抑制作用,明显抑制细胞克隆的形成和细胞的迁移力,且呈剂量-效应关系.流式细胞术检测发现:pShPCNA组细胞明显阻滞于G0/G1期,并出现明显的亚二倍体凋亡峰,出现明显的早期凋亡细胞群.荧光显微镜检测表明,细胞线粒体膜电位降低,并且细胞出现核固缩、凋亡小体等凋亡形态学变化.上述结果表明,成功构建了靶向PCNA基因的siRNA真核表达载体pShPCNA,pShPCNA转染HepG2细胞48h后,能够显著抑制细胞的生长增殖、诱导细胞凋亡、细胞周期阻滞于G0/G1期.

摘要：目的研究原花青素联合凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins,IAPs)家族成员Apollon小干扰RNA(small interfer-ence RNA,siRNA)对人肝癌(HepG2)细胞增殖、凋亡的影响。方法设计并合成Apollon siRNA的序列,将一定浓度的人工合成的Apollon siRNA经脂质体包裹转染肝癌(HepG2)细胞,运用实时荧光定量RT-PCR检测Apollon mRNA的表达水平,蛋白质免疫印记技术检测Apollon的蛋白表达水平,并筛选出Apollon siRNA的有效序列,并进一步联合不同浓度的原花青素作用于肝癌(HepG2)细胞48 h后,采用WST-8法检测单用Apollon siRNA、单用原花青素、及Apollon siRNA联合原花青素对肝癌细胞增殖抑制作用,流式细胞术检测细胞早期凋亡率;Hoechst 33258染色观察HepG2细胞凋亡形态。结果设计的三对Apollon siRNA序列,筛选出其中有一对(NO.2)能明显下调Apollon mRNA与蛋白的表达水平,Apollon siRNA联合原花青素作用于HepG2细胞48 h后,单用原花青素的IC50为25.24 mg.L-1;Apollon siRNA与原花青素联合使用,原花青素的IC50为9.99 mg.L-1,增敏倍数为2.53,表现为协同作用。流式细胞术检测结果显示:Apollon siRNA联合原花青素能促进HepG2细胞凋亡,其早期凋亡率达25.2%;经荧光显微镜观察,Apollon siRNA组可见核高强度荧光的细胞,并见凋亡小体。结论 Apollon siRNA可增强肝癌细胞对原花青素的敏感性,作用机制可能为共同促进肝癌细胞早期凋亡有关,为临床上肝癌的治疗提供理论基础。

摘要：目的:观察大肠埃希菌RNase P催化亚基M1 RNA在细胞外水平上对人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)DNA聚合酶UL54 mRNA的切割效果,探讨核酶作为新型抗病毒制剂的应用前景。方法:针对HCMVUL54 mRNA设计特异性的外部引导序列(external guide sequences,EGSs)EGS-T6,观察其引导M1 RNA特异的细胞外切割活性。结果:在EGS-T6引导下,大肠埃希菌RNase P催化亚基M1 RNA在细胞外可特异地对靶mRNA进行有效切割。结论:EGS-T6具备引导M1 RNA对UL54 mRNA特异切割的能力,可发展成一种新型抗病毒制剂。

摘要：目的:探讨在纤细眼虫(Euglenagracilis)中是否存在核纤层蛋白(lamin)基因,为核纤层蛋白基因的起源与进化研究提供线索.方法:以较为低等生物的核纤层蛋白基因cDNA序列为参考,设计引物P0010和P0012,以纤细眼虫总DNA为模板进行PCR,PCR产物回收、测序.由于不能获取完整序列,所以据测序结果又设计了P0013和P0014两条中间引物,组成P0010/P0013和P0014/P0012引物对进行PCR,回收产物测序.结果:P0010/P0012、P0010/P0013和P0014/P0012引物对进行PCR分别获得775、400和395bp的特异性PCR产物,对这3种产物分别测序,最终获得了P0010和P0012之间的全序列,共775bp.结论:在纤细眼虫中存在着核纤层蛋白基因.