摘要：目的探讨人蛋白激酶Cα(PKCα)小干扰RNA(siRNA)对肺癌A549细胞生长增殖及凋亡的影响。方法设计并化学合成6条PKCα siRNAs,转染A549细胞,通过改良MTT法及RT-PCR筛选;对3条效果较好的PKCα siRNAs,进一步采用克隆形成抑制实验、Hoechst 33258染色、PI单染和AnnexinⅤ/PI双染以及Western blot检测。结果6条PKCα siRNAs均显著下调了PKCα mRNA水平;除No.5siRNA外,其他5条siRNA均显著地抑制了A549细胞增殖(P<0.05)。3条效果较好的PKCα siRNAs转染组PKCα蛋白的表达显著下调,克隆形成抑制率、亚二倍体百分率和早期凋亡细胞比例均显著高于对照组(P<0.05),并出现了核固缩、边聚和裂解等凋亡形态学变化。结论本实验发现3条能显著抑制A549细胞增殖并诱导其凋亡的PKCα siRNAs。

摘要：目的观察特异性bcr/abl融合基因的siRNA对慢性粒细胞白血病K562细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并化学合成bcr/abl融合基因融合位点b3:a221个核苷酸siRNA作用于K562细胞,用WST-8法检测细胞增殖抑制率;RT-PCR检测bcr/abl mRNA表达水平;PI单染流式细胞仪检测细胞周期;AnnexinV-PI双染测定细胞凋亡比例;Hochest33258染色荧光显微镜观察细胞凋亡的形态学变化。结果①Bcr/ablsiRNA作用K562细胞24,48,72h后,明显抑制K562细胞增殖,各浓度组间的增殖抑制率差异无显著性(P>0.05);②Bcr/ablsiRNA能显著下调bcr/abl mRNA水平,各浓度组间差异无显著性(P>0.05);③Bcr/ablsiRNA作用组细胞周期阻滞于G1期;④Bcr/ablsiRNA作用后细胞出现明显的早期凋亡群,各浓度组间的早期凋亡率差异无统计学意义(P>0.05),细胞出现核固缩、核边集、凋亡小体等改变。结论特异性bcr/ablsiRNA可显着抑制K562细胞bcr/abl融合基因的表达,抑制细胞的增殖,诱导凋亡,但其作用未显示明显的剂量依赖性。

摘要：目的:探讨以microRNA-21为靶标的反义寡核苷酸对白血病K562细胞的生长抑制效应及可能的作用机制。方法:依据与microRNA-21序列互补的原理,设计反义寡核苷酸,人工合成并全硫代修饰,在Lipo-fectamineTM2000介导下,转染K562细胞。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法筛选最佳作用浓度,台盼蓝拒染法检测其对细胞生长抑制的作用,姬姆萨染色观察细胞的形态学变化,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期的变化。利用荧光定量PCR技术检测反义寡核苷酸作用后细胞内microRNA-21表达水平的改变。结果:MTT结果显示反义寡核苷酸有效抑制细胞生长,分别与随机组、空白对照组进行比较有显著差异(P<0.05),反义寡核苷酸作用的最佳浓度是0.6μmol/L。台盼蓝拒染法结果显示从转染K562细胞24 h开始,反义寡核苷酸组细胞生长明显受到抑制,抑制效应持续到72 h。姬姆萨染色显示反义寡核苷酸作用K562细胞24 h后,可在细胞中见凋亡小体。流式细胞仪检测结果显示反义寡核苷酸组出现明显的亚二倍体峰,细胞周期无发生明显变化。荧光定量PCR结果显示,反义寡核苷酸可有效抑制细胞内microRNA-21的表达水平。结论:以microRNA-21为靶标的反义寡核苷酸可有效抑制人白血病K562细胞的生长,并显著促进细胞凋亡。

摘要：目的:筛选出PDCD4 siRNA的有效序列,并研究其对白血病K562细胞药物敏感性的影响。方法:利用生物信息学的方法设计并合成3条PDCD4 siRNA候选序列,将PDCD4 siRNA候选序列分别转染K562细胞,用实时定量RT-PCR的方法(Real-time RT-PCR)筛选出能有效沉默PDCD4基因mRNA表达的序列,并用蛋白印迹法(Western blotting)检测该有效序列对细胞内PDCD4蛋白表达水平的影响。将有效序列转染k562细胞6 h后,分别与常用的抗白血病药物三氧化二砷(As2O3)、阿糖胞苷(Ara-c)、小檗碱(BB)联合作用72 h,用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)检测PDCD4 siRNA对细胞药物敏感性的影响。结果:用实时定量PCR成功筛选出一条有效干扰PDCD4mRNA表达的序列,用Western blotting法检测该序列可显著降低PDCD4蛋白的表达水平(P<0.05);与ATO,Ara-c,BB联合作用72 h后,PDCD4表达的下调降低了细胞的药物敏感性(P<0.05)。结论:沉默PDCD4能够显著降低白血病细胞的药物敏感性,PDCD4 siRNA能够显著挽救药物作用后的细胞活性。

摘要：目的:筛选有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列。方法:化学合成3对针对大鼠CRMP1基因的特异性siRNA,用脂质转染胺(lipofectamine)LTX转染大鼠海马神经元,通过流式细胞仪检测转染效率,使用RT-PCR与实时PCR检测CRMP1基因mRNA的表达,从而筛选抑制效率最高的siRNA。结果:流式细胞仪检测转染效率为52.5%。通过RT-PCR的初步检测和实时PCR的定量检测结果显示,与对照组相比,所设计的3对siRNA均能不同程度抑制CRMP1基因mRNA的表达,其中CRMP1-249 siRNA抑制效果最佳,抑制率达84.3%。结论:成功筛选出1对能有效抑制大鼠CRMP1基因表达的siRNA序列。

摘要：目的:探讨利用反向聚合酶链反应(反向PCR)技术根据毕赤酵母偏爱密码子优化截短型人乳头瘤病毒58型(HPV58)L1基因的研究。方法:设计PCR引物扩增截短型HPV58L1目的基因,将其克隆入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC;测序并对目的基因进行序列分析;根据毕赤酵母偏爱密码子利用反向PCR技术设计引物对目的基因进行扩增。结果:扩增了截短型HPV58L1基因并将其克隆入毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC中;根据毕赤酵母偏爱密码子优化了截短型HPV58L1基因。结论:成功构建经密码子优化截短型HPV58L1基因的毕赤酵母分泌表达载体pPICZαC-HPV58L1。

摘要：目的:探讨Rho激酶对大鼠海马神经元突起生长和骨架相关蛋白mRNA表达的影响。方法:用Rho激酶的抑制剂Y-27632和激动剂溶血磷脂酸(LPA)干预海马神经元,观察突起的生长并用RT-PCR检测大鼠海马神经元神经丝结合蛋白(Dbn1)、微丝肌动蛋白(F-actin)、微管相关蛋白(Tau)、α-微管蛋白(α-tubulin)mRNA的表达。结果:用LPA干预2 h后突起从远端逐渐退缩,长度缩短,细小突起退缩明显;Y-27632干预2 h后细胞胞体和突起的远侧端新生出细小突起。RT-PCR实际扩增长度与设计长度相吻合。内参照β-actin电泳条带在不同分组灰度较均一,呈高表达。Dbn1呈较高水平表达,激动剂LPA组表达下降(P<0.05),抑制剂Y-27632组表达量增多(P<0.05);F-actin和Tau表达呈低水平,激动剂作用后均使表达量相应的减少(P<0.05),抑制剂组表达增多(P<0.05);α-tubulin表达量最高,激动剂组表达量出现明显下降(P<0.05),抑制剂组表达增加(P<0.05)。结论:激活Rho激酶下调Dbn、F-actin、Tau、α-tubulin mRNA的表达并诱导突起缩短,抑制则增加其表达并促进突起生长。

摘要：背景:体外培养软骨细胞经历多次传代后,其增殖能力将逐渐退化。实验表明,碱性成纤维细胞生长因子可促进软骨细胞增殖,并可能影响软骨细胞的表型与分化。目的:观察碱性成纤维细胞生长因子对生长板软骨细胞增殖和分化的影响,并筛选其用于体外软骨细胞培养的最佳剂量。设计、时间及地点:以细胞为观察对象的观察对比实验,于2004-10/2005-02在暨南大学医学院生化教研室组织工程实验室完成。材料:选用12只新西兰白兔用于分离软骨细胞,碱性成纤维细胞生长因子由英国PeproTech公司生产。方法:分离并在低血清条件下培养兔生长板软骨细胞。根据实验需要加入0,1,2.5,5,10,25,50及100μg/L8个剂量的碱性成纤维细胞生长因子,进行各项指标观察。主要观察指标:应用改良四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞增殖倍数;应用羟脯氨酸法测定软骨细胞胶原产量;应用酶动力学方法测定碱性磷酸酶活性。结果:①碱性成纤维细胞生长因子剂量在5～100μg/L范围内可以促进软骨细胞增殖,并以25μg/L时刺激效果最为显著。②当碱性成纤维细胞生长因子剂量高于25μg/L时,软骨细胞的胶原合成被抑制。③当碱性成纤维细胞生长因子剂量高于1μg/L时,软骨细胞的碱性磷酸酶活性被抑制。结论:碱性成纤维细胞生长因子可以刺激生长板软骨细胞增殖,并在剂量高于25μg/L时抑制生长板软骨细胞的分化。

摘要：构建并筛选出能在哺乳细胞表达的重组质粒。方法：以含ＧＦＰｃＤＮＡ报告者基因的穿梭质粒ｐＧＦＴ，－１为载体，选用人巨细胞病毒启动子，采用基因重组技术构建重组质粒。结果：重组质粒及其酶切液的琼脂糖凝胶电泳图谱表明重组质粒的构建成功。结论：该研究技术路线设计合理，以构建的重组质粒为分子工具，可望建立以ＧＦＰ基因为基础的有效的基因标记系统。

摘要：目的应用基因芯片技术,研究微RNA(miR-181a)对人白血病K562细胞基因表达谱的影响。方法针对miR-181a成熟序列设计并合成miR-181aRNAduplexes,采用OligofectamineTM脂质体法转染K562细胞。应用AgilentHuman1A寡核苷酸基因芯片,检测和分析对照组与微RNA转染组间的基因表达谱差异。结果从20173个候选基因中,筛选出228个差异表达基因。与对照组K562细胞比较,表达上调的基因有59个,主要有代谢相关基因、抑癌基因、信号转导相关基因、免疫防御相关基因等;表达下调的有169个,主要有原癌基因、DNA结合与转录因子、代谢相关基因、信号转导相关基因、细胞周期及发育相关基因等。RT-PCR技术验证了CTCF、ZAP70、SEMA4C和RALA4个基因表达的变化。结论微RNA转染K562细胞48h后,影响了细胞内一系列基因的表达。这些基因可能与微RNA的功能相关,同时也是转录后水平上抑制基因表达的调控方式实现的基础。这为进一步深入研究微RNA的功能及其具体的作用机制提供了重要的线索和依据。