摘要：目的 ：通过特异性小干扰RNA（small interference RNA,si RNA）抑制人黑素瘤A375细胞中表皮生长因子样结构域蛋白6（epidermal growth factorlike-domain 6,EGFL 6）基因表达,探讨EGFL 6基因沉默对人黑素瘤细胞增殖及侵袭的影响。方法：设计合成靶向EGFL 6基因的siRNA（命名为EGFL6-siRNA）,通过脂质体转染法将该siRNA转染入黑素瘤A375细胞,然后采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测黑素瘤A375细胞中EGFL6 mRNA及蛋白的表达水平,细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）法和Transwell实验分别检测A375细胞增殖和侵袭能力的变化。结果：在成功转染EGFL6-siRNA 48 h后,A375细胞中EGFL6 mRNA及蛋白表达水平均明显下降（P值均〈0.01）。EGFL6-siRNA转染组A375细胞在转染后24~72 h各时间点的细胞增殖能力均受到明显抑制（P值均〈0.01）,且细胞侵袭能力显著降低（P〈0.01）。结论：特异性siRNA能够有效地沉默人黑素瘤A375细胞中EGFL 6基因的表达,并抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。

摘要：【目的】克隆表达单增李斯特菌膜表面蛋白InternalinA(InlA),经免疫家兔获得多克隆抗体,为建立其免疫磁珠富集快速检测方法奠定基础。【方法】利用生物软件设计单增李斯特菌inlA基因的引物,通过PCR扩增出inlA基因,并将其克隆至pET28a()原核表达载体,转化大肠杆菌BL21进行优化表达。镍柱纯化表达产物,质谱鉴定重组蛋白,ELISA分析其免疫原性。免疫家兔,制备其多克隆抗体。间接ELISA检测多抗的效价及交叉性,免疫荧光分析多抗与单增李斯特菌菌体结合的特异性。【结果】成功表达了InlA蛋白,融合表达产物分子量约为92 kD,质谱鉴定其为InlA蛋白;免疫家兔获得的抗血清效价为1:100 000,除与金黄色葡萄球菌约20%的交叉外,与副溶血弧菌等其它病源菌均无交叉;免疫荧光证实该多抗特异性结合于单增李斯特菌膜表面,与同种属的威尔斯李斯特菌不结合。【结论】成功制备了单增李斯特菌特异性的兔多克隆抗体,为单增李斯特菌免疫磁珠富集快速检测方法的建立奠定了基础。

摘要：目的分析不同虾蟹过敏原组分间的交叉反应,探讨交叉过敏原在虾、蟹等甲壳类过敏食物检测、诊断和疫苗设计中的意义。方法运用20例虾过敏患者血清和制备的凡纳滨对虾主要过敏原-原肌球蛋白的8株单克隆抗体(mAbs),通过Western blot和间接竞争ELISA分析凡纳滨对虾、日本沼虾和梭子蟹的交叉过敏反应及它们的主要交叉过敏原。结果 Westernblot的结果显示,凡纳滨对虾、日本沼虾和梭子蟹分别能与85%、85%和75%的虾过敏患者血清IgE特异性反应;间接竞争ELISA的结果显示,3种虾蟹粗提液均可显著抑制虾过敏患者血清IgE与凡纳滨对虾蛋白的结合,最大抑制率分别93%、84%、60%;8株凡纳滨对虾原肌球蛋白的mAbs与日本沼虾和梭子蟹的Western blot和间接竞争ELISA反应中,6株mAbs可与日本沼虾和梭子蟹的相对分子质量为36 000蛋白反应。结论凡纳滨对虾、日本沼虾和梭子蟹之间存在交叉过敏反应,且具有多个交叉过敏原,其中原肌球蛋白是主要的交叉过敏原。

摘要：构建重组基因克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白ompK并制备多克隆抗体,建立副溶血弧菌的免疫磁珠富集,结合化学显色检测方法。利用生物软件Primer 5设计副溶血弧菌ompK基因的引物,通过PCR扩增出ompK基因,并将其克隆至pET28a(+)原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21进行优化表达。镍柱纯化表达产物,免疫小鼠,制备其多克隆抗体。Western blot鉴定重组蛋白,ELISA分析其免疫原性。间接ELISA检测多抗效价及交叉性,并与protein G磁珠偶联结合显色平板检测副溶血弧菌。结果显示,成功表达ompK蛋白;免疫小鼠获得特异性抗血清,效价为1∶64 000;Western blotting证明抗血清能与副溶血弧菌28 kD处条带特异性结合。制备的免疫磁珠敏感度最高能达到104CFU/mL。成功克隆表达副溶血弧菌外膜蛋白ompK并制备副溶血弧菌特异性鼠多克隆抗体,建立的免疫磁珠检测方法与显色平板法结合较传统的二次增菌法能够节省72 h,整个过程只需要传统方法时间的1/3;相比于常用的免疫学检测方法检测灵敏度提高两个数量级。