摘要：【背景】新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的传染可能会引发作为二类传染病之一的新城疫(Newcastledisease,ND),给养禽业带来巨大的经济损失,因而早期、精准的NDV筛查是防治ND暴发的关键。【目的】针对新城疫病毒(NDV)建立结合TaqMan探针的反转录环介导等温扩增技术(RT-TaqMan-LAMP)快速检测方法。【方法】根据NDV F基因序列设计特异性引物组和TaqMan探针,以重组质粒pMD-NDV-F为阳性标准品优化反应条件,验证该方法的特异性、灵敏性和重复性,同时与国家标准(GB/T16550—2020)中推荐的RT-qPCR方法比较,对70份实际样本进行验证。【结果】最佳反应条件为61℃60 min。引物和探针最优浓度:1.6μmol/L(FIP/BIP)、0.2μmol/L(F3/B3)、0.8μmol/L(LF/LB)、0.2μmol/L(GTP)。最低检测限为1.651×10^(2)copies/μL,灵敏性是LAMP方法的100倍。无非特异性扩增,与禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)、鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)、鸡传染性囊病病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)及疱疹病毒(herpes virus,HSV)均无交叉反应,批次内和批次间变异系数(coefficientofvariation,CV)均小于3%。在70份临床样品的检测中本方法比RT-qPCR方法多检测出1份阳性样本,经2次复测二者的符合率为98.57%。【结论】本研究建立的NDVRT-TaqMan-LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,并能有效避免非特异性扩增,可用于NDV的精准检测和流行病预防。

摘要：根据细菌的16S rDNA 3′端和23S rDNA 5′端的高度保守区设计引物,PCR扩增了2株创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的16S-23S rDNA 间区(Intergenic spacer,IGS),克隆到pGEM-T载体上,测序。用BLAST和 DNAstar软件对16S-23S rDNA 间区序列及其内的 tRNA 基因进行比较分析。结果表明,2 株创伤弧菌共测出 9 条 16S-23S rDNA 间区序列, 其中ZSU006 测出 5 条, 间区类型分别为:IGSGLAV、IGSGLV、IGSIA 、IGSA和 IGSG。其中 IGSGLAV最大,包含 tRNAGlu、tRNALys、tRNAAla 和 tRNAVal基因;IGSGLV包含 tRNAGlu、tRNALys和 tRNAVal基因; IGSIA,则包含 tRNAIle和 tRNAAla基因;IGSG仅包含tRNAGlu基因;而IGSA仅包含tRNA Ala基因。菌株CG021测出的16S-23S rDNA IGS序列有4条,除缺少IGSA外,其余的IGS类型均与ZSU006的相同。与GenBank内的创伤弧菌ATCC27562 的IGS序列比较,发现创伤弧菌所有类型的IGS的tRNA基因两端的非编码区具有较高的种内同源性。16S-23S rDNA 间区结构的差异为建立一种新的创伤弧菌检测方法奠定了基础。

摘要：提要应用BLAST程序和DNAstar软件,比较分析了5株副溶血弧菌和其他细菌的16S—23S rDNA间区序列,选取IGSIA作为扩增靶区,结合相邻的16S rDNA序列,设计合成了一对特异性引物,通过优化扩增条件,建立了快速检测副溶血弧菌的PCR方法,对其特异性和敏感性进行了探讨,并初步进行了应用研究。结果表明,新建的PCR方法能特异性地扩增出大小为306bp和552bp的2条带,分别对应于副溶血弧菌的IGS0和IGSIA,检测灵敏度为5.6×102CFU/ml,半个工作日即可得到准确的结果,能有效检测出在杂色鲍、凡纳滨对虾和各种水质中的副溶血弧菌,适用于海洋水产动物副溶血弧菌病的早期快速诊断、水产品的检疫及水质环境的监测。

摘要：动物rRNA基因是一种GC含量较高、结构复杂的重复序列。该研究结合亲缘生物法生物信息学技术,经反复摸索后选用LA PCR法即LA PCR Taq酶结合GC缓冲液来扩增鳜鱼复杂的rRNA基因重复序列,经测序鉴定最终克隆了鳜鱼的3个rRNA基因及其2个间隔序列。分析了鳜鱼与相关动物的rRNA基因序列的同源性和进化关系。探索了克隆复杂DNA序列时引物设计的特别规则、反应体系的改进、DNA聚合酶的选用、循环参数的调整等措施。

摘要：通过单因素试验、正交试验的方法,对影响锁阳ISSR-PCR反应体系的7种主要因素在3个水平上进行优化筛选,得到锁阳ISSR-PCR反应的最佳体系:25μL反应体系中含有0.2 mmol/L dNTP、1.5 mmol/L Mg2+、10μmol/L引物、50 ng模板DNA、2.0 UTaq酶、1%去离子甲酰胺和2.5μg/μL牛血清白蛋白。相应引物的最佳退火温度为48.9℃。这一体系的建立为今后利用ISSR-PCR标记技术研究锁阳的遗传多样性奠定了基础。同时对ISSR-PCR体系中添加剂的作用进行了探讨,为添加剂在其他植物ISSR-PCR反应中的应用提供借鉴。

摘要：目的:研究芪丹煎剂有效成分超声法提取的最适条件。方法:利用正交试验设计,对水量、提取时间和提取次数进行分析,找出最适条件。按最适条件重复3次,考察重复性。结果:水量为14倍、提取时间为30min,提取次数为3次时有效成分的总含量最大,3次平行试验有效成分总含量RSD为0.86%。结论:超声法提取的最佳条件为:水量14倍、提取时间30min,提取次数3次。本方法重复性较好。

摘要：根据斜带石斑鱼(Epinephelus coioids)神经坏死病毒(orange-spotted nervous necrosis virus,OGNNV)的主衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)基因的保守序列,设计一对引物,从感染OGNNV的斜带石斑鱼组织匀浆液提取RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到426 bp的cDNA片断。用得到的RT-PCR产物加上地高辛(DIG)标记作为核酸探针。通过注射病毒提取液人工感染一组斜带石斑鱼,解剖感染病毒的斜带石斑鱼,从中分离出脑和眼睛,运用原位杂交技术检测组织中的OGNNV。实验表明,原位杂交具有较高的灵敏性和特异性,可以用原位杂交的办法来检测养殖的石斑鱼是否有携带该病毒,达到监控和预防神经坏死病爆发的目的。本实验还采用了H&E染色方法检测了感染NNV的石斑鱼脑部和眼部组织,观察细胞内的坏死部分。与原位杂交做对比,提高了检测的可靠性和准确性。本实验建立的石斑鱼神经坏死病毒的ISH检测方法有着较高的特异性和敏感性,易于操作,有助于石斑鱼神经坏死病毒的组织定位、发病机理的研究。

摘要：该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术,为获得稳定遗传的转基因动物或基因治疗临床应用解决技术难题.首先利用OPEN平台设计、构建能识别人基因组内rDNA基因间隔序列的锌指蛋白基因序列,与FokⅠ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因,再构建锌指核酸酶真核表达载体.另外,构建含有2条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因(EGFP)的多位点基因打靶载体.将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染HEK293细胞,内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率,结果显示单独转染多位点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%;而由于锌指核酸酶在染色质DNA上切割rDNA基因的间隔序列,诱导高效同源重组,锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率为24.2%,较常规基因打靶定点整合率(10-6～10-5)提高了24000多倍.共转染的HEK293细胞在无任何筛选的条件下持续培养2个月,经过20次传代之后,子代细胞能够持续表达EGFP,提示表达稳定.本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术,不仅大大提高了外源基因的定点整合效率,而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性,为动物定点转基因和人类基因治疗提供了重要的技术平台,具有广泛的应用前景.

摘要：血栓性疾病具有潜伏期长、发病突然、致死率高的特点,严重威胁人们的生命健康。血栓病灶的早期诊断及有效溶栓是决定治疗效果的关键因素。然而,现阶段临床影像学技术尚无法识别急性新发血栓,极易误诊而延误治疗时机;且临床溶栓治疗主要利用纤溶酶原激活剂(PA)实现,但PA治疗窗口期短、体内清除迅速,存在引发颅内出血的风险。基于纳米技术的靶向递送系统已成为血栓诊疗领域的新兴技术之一,针对血栓生物标志物设计开发的靶向纳米体系是实现血栓早期诊断及溶栓治疗的研究热点。

摘要：对从不同生态环境中分离得到的20株光合细菌,进行5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)的产量检测,结果显示一株分离自广州市云溪公园池塘底泥的菌株R5,其5-ALA产量最高,达4.92 mg/L.根据GenBank上公布的5-氨基乙酰丙酸合成酶hemA基因序列,设计引物进行hemA基因的克隆.结果表明,菌株R5的hemA基因序列长1230 bp,不含HindⅢ酶切位点,G+C为64.68%,编码一个409个氨基酸的酶蛋白,分子质量为44.9 ku,与Rho-dopseudomonas palustrisKUGB306菌株的hemA基因序列相似性为98.6%,氨基酸序列相似性为100%.系统发生树显示,菌株R5与Rhodopseudomonas palustris处在一个分支,显示菌株R5可能是Rhodopseudomonas palustris,这与微生物鉴定实验的结果一致.本研究克隆的高产5-氨基乙酰丙酸菌株的hemA基因,为后期获取高产5-ALA的基因工程菌打下基础.