摘要：目的:探索定向转染内源性光感受蛋白黑视素(melanopsin/opsin 4,Opn4)基因进入给光型双极细胞后,视网膜变性小鼠模型中视网膜神经元的光反应以及整体视觉行为的改变。方法:选用由甲基亚硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea,MNU)诱导的成年CD1小鼠作为视网膜变性模型。于P0～P1 CD1乳鼠视网膜底注射Grm6-Opn4-GFP质粒,Grm6-GFP作为阴性对照。通过电转进行基因转染。术后5周对基因转染小鼠腹腔注射MNU诱导视网膜感光细胞变性,对照组注射生理盐水,共设计5个实验组:正常对照组(normal)、生理盐水Grm6-Opn4-GFP对照组(NS+melanopsin)、MNU诱导模型Grm6-Opn4-GFP治疗组(MNU+melanopsin)、MNU诱导模型Grm6-GFP对照组(MNU+GFP)和MNU诱导组(MNU)。诱导后连续7 d进行明暗箱测试,统计动物在暗箱中的活动时间比。随后进行视网膜电图(electroretinogram,ERG)测试,计算体现给光双极细胞光反应的b波峰值、潜伏期和反映视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)光反应的明视负波反应(photopic negative response,PhNR)。利用免疫荧光法检测动物视网膜黑视素基因转导效果。结果:黑视素可以被定向转染进入视网膜给光双极细胞。明暗箱实验显示MNU诱导7 d后Grm6-Opn4-GFP转染的CD1小鼠滞留在黑箱的时间显著长于未转染组(P<0.05),ERG测试显示Grm6-Opn4-GFP转染的CD1小鼠的b波也有明显恢复(P<0.05)。结论:定向转染内源性光感受蛋白黑视素基因进入给光型双极细胞可部分恢复视网膜变性模型动物视觉。

摘要：目的检测嘌呤受体P2X_7信使RNA(mRNA)及其蛋白在RGC-5细胞系的表达。设计合成针对P2X_7受体的小型干扰RNA(siRNA),并筛选出其中能高效抑制其表达的序列。方法采用RT-PCR、Western blot及免疫荧光检测P2X_7受体mRNA及蛋白在RGC-5细胞系中的表达情况,并与小鼠视网膜及其他组织进行比较。设计针对P2X_7受体的3对干扰序列(P2X_7-siRNA-1～3),使用ribo FECTTMCP转染RGC-5细胞,60 h后检测细胞中P2X_7受体mRNA及蛋白表达变化。结果RGC-5细胞系与小鼠视网膜组织均能检测到P2X_7受体mRNA及蛋白的表达,且该受体主要表达于RGC-5的细胞核和细胞质。P2X_7-siRNA-3可同时有效下调P2X_7的mRNA和蛋白的表达。结论RGC-5可作为体外研究P2X_7受体作用的细胞模型。成功筛选出的针对P2X_7受体基因的siRNA将为后续下调该受体、减轻青光眼性视神经病变的基因治疗奠定基础。