摘要：为了研究84K杨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)家族中HD2亚家族成员在逆境胁迫应答中的表达模式,从84K杨中克隆得到PagHDT901、PagHDT902和PagHDT903基因的cDNA编码序列。生物信息学分析表明,这3种蛋白属于亲水蛋白,都具有NPL结构域。亚细胞定位发现,这3种蛋白均定位在细胞核中。84K杨HD2亚家族基因的表达具有组织特异性,在叶片中表达量最高。设计干旱、盐、寒冷的模拟逆境,通过Real-time PCR方法,分析了84K杨HD2亚家族基因在不同逆境条件下的表达模式。研究结果表明,84K杨HD2亚家族基因积极响应逆境胁迫,推断该家族基因可能参与84K杨的抗逆防御调节过程。

摘要：【目的】分析土壤含水量对玫瑰茄萼片花青素含量以及二氢黄酮醇⁃4⁃还原酶(DFR)基因表达水平的影响,为玫瑰茄栽培时的水分管理以及进一步明确DFR基因在花青素合成中的功能提供参考。【方法】以玫瑰茄品种‘广东早熟’为试验材料,分别设置了33%(极度干旱)、55%(轻度干旱)、80%(渍涝)3个土壤含水量处理,分别测定各处理下开花后10(前期)、20(中期)、30 d(后期)玫瑰茄萼片中花青素的含量以及5个DFR基因的表达量,并对花青素含量与DFR基因表达量的相关性进行了分析。【结果】(1)不同土壤含水量下,随着开花时间的推移,玫瑰茄萼片花青素含量均呈下降趋势,且开花前期与开花后期的差异显著;含水量为80%时,花青素含量下降幅度最大;开花前、中期,土壤含水量为33%的花青素含量明显低于土壤含水量为55%、80%的含量;开花后期,3个土壤含水量处理的花青素含量差异不显著。(2)不同土壤含水量下,DFR基因的表达量随着开花时间的推移呈现不同的变化趋势。土壤含水量为33%时,5个DFR基因的表达量高于其他两个含水量处理,且在开花后30 d显著上调,达到最高值,其中,DFR4表达量最高,DFR5表达量最低;土壤含水量为55%、80%时,5个DFR基因的表达量均较低。(3)土壤含水量为55%时,DFR4、DFR5表达量与花青素含量显著相关,表明其为调控花青素合成的关键基因。【结论】严重的干旱和渍涝都不利于玫瑰茄萼片花青素的合成;干旱胁迫促进了DFR基因的表达,而渍涝情况下DFR基因的表达受到了抑制;DFR4、DFR5基因为调控玫瑰茄花青素合成的关键基因。

摘要：[目的]早期快速精准鉴定马尾松和火炬松杂交子代,选育高抗马尾松×火炬松家系,以期更好地防控松材线虫病。[方法]本研究以马尾松为母本,火炬松为父本进行杂交,比对火炬松和油松基因组序列设计特异性引物,筛选马尾松与火炬松种间特异性引物,对杂交后代进行扩增条带分析,建立马尾松×火炬松快速鉴定体系,通过接种松材线虫评价筛选高抗家系。[结果]从150对引物中筛选出12对引物组合用于鉴定,特异性强,稳定性好,且扩增率高。F1代29个家系共88个样本,其中81株鉴定为杂交植株,杂种率为92.05%;F2代21个家系共688个样本,其中279株为杂交植株,杂种率为40.55%;对马尾松×火炬松F2代13个家系进行抗性评价,获得5个高抗家系。[结论]12对引物组合可作为马尾松和火炬松杂交子代真实性鉴定,筛选获得5个高抗家系,为松材线虫病防控和抗性机理研究奠定基础。

摘要：【目的】开发簸箕柳和三蕊柳种特异性KASP引物,为开展簸箕柳和三蕊柳杂交选育速生、抗虫新种质的真实性鉴定提供参考。【方法】利用簸箕柳和三蕊柳重测序数据,开展全基因组SNP位点分析,筛选出种特异性的SNP位点并设计KASP引物,利用SeqHunter2检测设计引物在簸箕柳中的通用性,并利用簸箕柳和三蕊柳自然群体材料对合成的引物进行实验验证,筛选出簸箕柳和三蕊柳种特异性KASP引物,并对它们的杂交子代进行真实性鉴别。【结果】将三蕊柳和簸箕柳重测序的数据比对到三蕊柳基因组,共获得个6598144个SNPs。经过筛选,最终在簸箕柳中检测到674144个和三蕊柳相比为纯合突变的位点。从每条染色体上随机选取100个位点用于KASP引物设计,在1900个SNPs位点中,750个SNP位点可以成功设计出KASP引物。从每条染色体上选取2组,共选取38组引物,通过SeqHunter2检测得到11组引物在簸箕柳中是通用的。利用簸箕柳和三蕊柳自然群体DNA对合成的10组通用引物进行种内保守和种间差异性检测,获得4组在簸箕柳、三蕊柳和种间杂交子代中聚类明显的引物。引物Stri08_82809、Stri14_11602、Stri14_12274和Stri17_10731在簸箕柳自然群体中分别扩增出纯合G/G、T/T、A/A和T/T位点,在三蕊柳自然群体分别扩增出纯合A/A、C/C、G/G和C/C位点,而在真实杂交子代中分别扩增出G/A、T/C、A/G和T/C杂合位点。利用上述4组引物对簸箕柳×三蕊柳的杂交子代进行鉴定,发现在31个杂交子代中,29个个体扩增出杂合位点,说明同时遗传了2个亲本的特征位点,为真实的种间杂交子代。有2个个体扩增的位点为纯合且和母本相同,说明这2个子代为簸箕柳花粉污染的子代。【结论】本研究获得了簸箕柳和三蕊柳种间特异性KASP标记4组,可以准确快速的开展簸箕柳和三蕊柳种间杂交子代的真实性鉴别,为进一步簸箕柳和三蕊柳种间杂交及回交创制抗虫新品种提供了技术支持。

摘要：【目的】为培育更多的彩叶树种,以满足人们对城市园林绿化美景的追求,采用分子设计育种手段创制黄叶裂叶桦(Betula pendula‘Dalecarlica’)。【方法】以裂叶桦茎段为材料,通过农杆菌介导法将前期构建的35S::BpGLK1-RNAi载体导入其基因组中,进而对获得的抗性转基因株系进行DNA水平及mRNA的检测,同时测定裂叶桦BpGLK1干扰表达株系的叶色、光合色素及光合参数、株高生长、基因表达特性。【结果】实验共获得8个抗除草剂再生转化株系,分子检测表明,BpGLK1干扰序列分别整合于8个转基因株系基因组中,且这些转基因株系中的BpGLK1相对表达量均呈下调表达。对移栽田间的1年生转基因株系叶色、叶色参数和叶绿素相对含量调查发现,8个转基因株系中RE1—RE5为黄叶株系,RE6—RE8为绿叶株系;相对于WT及绿叶株系,黄叶株系叶色参数L^(*)及b^(*)显著升高,叶绿素a及叶绿素b含量降低,但叶绿素a与b的比值呈上升趋势。转基因株系与野生型(WT)株系相比净光合速率(Pn)没有显著差异。株高分析显示,4个转基因株系显著高于WT株系;3个株系与WT株系差异不显著。基于RNA-Seq找到的显著下调的差异基因BpCOL、BpLCHⅡ、BpPDS和BpFKBP的qRT-PCR分析显示,上述4个基因在RE1—RE3中均呈显著下调表达趋势。【结论】导入的GLK1干扰靶序列能够降低转基因裂叶桦BpGLK1基因表达量,并获得了在园林绿化中具有潜在应用价值的黄叶裂叶桦。

摘要：“作物育种4.0”的提出,为我国林木遗传育种指明了向智能分子设计育种发展的前进方向。本文提出了理想品种的概念及其智能设计实现条件,简要综述了我国林木遗传育种研究历史以及存在的问题,并提出了推动我国林木智能分子设计育种的发展对策等。林木遗传育种应该瞄准国家林业重大需求,有组织地选择重要树种系统布局,在推动树种高世代遗传改良及其利用的同时,准备系谱关系清晰的育种资源群体,做到等位变异有迹可循;解析重要性状遗传变异规律及其调控网络,实现基因调控有据可查;建立高效的多组学大数据整合分析以及育种群体构建、亲本选配和后代选择等分子设计育种技术方法体系,保证智能育种有“法”可依等。逐步解决我国林木遗传育种中存在的问题,为实施林木智能设计育种创造理想条件。在每一育种世代品种向理想品种选育的推进过程中,尽可能将智能分子设计育种的最新理论和技术成果应用于育种实践,选育出高产、优质、高抗的当前世代理想品种,满足国家林业发展的现实需要。

摘要：【目的】CRISPR/Cas9 RNP系统是一种高效的基因编辑技术,具有简单、精准等特点,已被广泛应用于动、植物的基因编辑研究中。目前,通过微粒轰击技术将Cas9蛋白和gRNA核糖核蛋白复合体(RNP)导入受体细胞,获得无选择标记的基因编辑植物,该技术的提出为快速创制植物突变体提供了崭新思路。【方法】本研究以白桦(Betula platyphylla×***)BpGLK1基因为编辑的靶基因,采用CRISPR/Cas9 RNP技术开展无T-DNA插入的BpGLK1基因编辑。在白桦BpGLK1基因的第1外显子处设计靶位点,采用PCR扩增技术获得BpGLK1-E1靶位点片段;采用酶切及连接技术构建pAbAi-BpGLK1-E1重组质粒,将该质粒线性化后与Cas9蛋白作用,体外检测CRISPR/Cas9 RNP活性及gRNA的精准性。以白桦合子胚诱导的愈伤组织为受体,采用微粒轰击技术进行BpGLK1定向诱变。【结果】CRISPR/Cas9 RNP体外活性检测显示:Cas9蛋白及gRNA复合体具有裂解活性,可在BpGLK1靶位点的特定位点进行有效切割。以白桦成熟胚为材料,在无光照条件下培养25 d左右可获得幼嫩愈伤组织,以其为受体在轰击距离为12 cm、7584.5 kPa条件下,用包被Cas9蛋白与gRNA(RNP)金粒进行轰击,随后经过分化培养及继代培养可获得叶色呈现黄绿色的glkc突变株,测序结果显示,该突变株的BpGLK1基因产生18 bp的纯合缺失突变。【结论】利用CRISPR/Cas9编辑技术可实现无T-DNA插入的白桦BpGLK1精准突变。

摘要：【目的】远缘杂交可以实现有利基因的聚合,是种质创新的重要手段。杨属有些派间杂交困难,且杂交子代从形态学难以区分,本研究开发杨属不同派间的特异性引物,为派间杂交创制新种质的真实性鉴定提供技术支撑。【方法】利用在美洲黑杨和小叶杨中种特异性InDel位点设计引物,并利用SeqHunter2依次比对胡杨、山杨、小叶杨和大叶杨基因组,再用杨属5个派的自然群体材料进行种内保守及种间多态引物的试验验证,筛选出杨属不同派的特异性引物序列,对杨属不同派间杂交子代进行真实性鉴别。【结果】将从美洲黑杨基因组设计的5000对InDel引物依次分别比对胡杨、山杨、小叶杨和大叶杨基因组,最后筛选出341对引物在上述5个种中是通用的。从不同染色体上共选取48对引物并合成,利用5个树种各1个DNA检测得到43对引物是通用的,其中19对引物在不同种中扩增条带单一且存在差异。利用自然群体混合DNA对试验验证的19对通用引物进行种间多态性和种内保守性检测,初步获得4对多态性引物。最后再用自然群体DNA对这4对引物进行扩增检测,发现引物Chr12_4341229和Chr13_10582756在美洲黑杨、小叶杨、山杨、大叶杨和胡杨中均只能扩增出一个位点,引物Chr12_4341229扩增条带分别为148、152、113、152和159 bp,引物Chr13_10582756扩增条带分别为140、144、116、140和159 bp。利用上述2对引物对小胡杨2号、黑胡杨和黑小杨进行鉴定,发现所有杂交子代个体均能检测它们2个亲本的特征带。引物Chr12_4341229和Chr13_10582756一起使用,可以用于美洲黑杨、小叶杨、山杨、大叶杨和胡杨任意组合杂交子代的真实性鉴别。【结论】本研究获得了杨属5个派间的5个种的特异性InDel引物2对,可以有效地进行杨属不同派5个种之间任意组合种间杂交子代的真实性鉴别,为进一步开展杨树派间杂交创制新种质提供了技术支持。

摘要：未减数配子是植物多倍化的源动力,也是植物多倍体育种的重要手段和工具。自然界植物多倍体的自发形成主要包括有性多倍化和无性多倍化2条途径,其中有性多倍化途径在植物界占据着绝对统治地位。本文在分析文献的基础上,从性母细胞减数分裂染色体行为、减数分裂微管骨架、细胞质分裂等异常细胞学现象,减数分裂转变调控以及2n配子发生的分子调控等3个方面,对植物2n配子发生机理研究进展进行了综述,并讨论了植物2n配子利用过程中存在的问题。指出综合利用高通量测序、生物信息学和多组学分析技术,发掘2n配子发生的关键基因,并验证其生物学功能,解析植物2n配子发生的分子调控机理,可能是未来植物2n配子发生机理研究领域的热点。提出综合利用生物信息学分析技术和CRISPR-Cas9等现代基因编辑技术,开展精准分子设计育种,可能是从根本上解决单倍性花粉授粉竞争问题、提高三倍体诱导效率的有效方法。

摘要：【目的】研究秋水仙素溶液质量浓度、处理时间和预培养时间对‘京枣39’离体多倍体诱导的影响,优化枣树良种‘京枣39’的增殖和生根培养基,建立‘京枣39’的离体多倍体诱导体系,获得多倍体植株。【方法】采用完全随机区组试验设计,探索不同秋水仙素溶液质量浓度和处理时间组合对‘京枣39’不定芽再生的影响,不同预培养时间对‘京枣39’离体多倍体诱导的影响,不同生长调节剂组合对‘京枣39’增殖培养的影响,不同基本培养基和生长调节剂组合对‘京枣39’组培苗生根培养的影响。【结果】(1)当秋水仙素溶液质量浓度为80 mg/L、处理48 h时‘京枣39’刻伤叶片存活率为(50.00±7.07)%,分化系数为(2.06±0.17)。(2)最佳预培养时间为6 d,并施以80 mg/L秋水仙素浓度处理48 h,获得了纯合四倍体‘京枣39’。(3)最佳增殖培养基为MS+0.8 mg/L 6-BA+0.4 mg/L IBA+30 g/L麦芽糖,pH=5.8,平均增殖系数为(4.22±0.22)。(4)最佳生根培养基为改良1/2MS+0.8 mg/L IBA+30 g/L麦芽糖,pH=5.8,平均根长为(5.22±0.19) cm;平均生根数为(3.20±0.22)。【结论】初步建立了‘京枣39’的离体多倍体诱导体系,获得了‘京枣39’的多倍体植株,并优化了其增殖培养及生根培养方法。本研究为优良枣树品种‘京枣39’的种质创新提供了切实可行的技术方法,为多倍体诱导在枣树以及其他果树中的应用奠定了试验基础。