摘要：目的探讨线粒体ND1基因3316G—A突变对线粒体生物学功能的影响及其在糖尿病发病中的作用。方法利用真核表达载体pcDNA3．1B和大肠杆菌DH5α构建野生型和线粒体DNA的ND1基因3316G—A突变型重组子pcDNA3．1B—ND1；设计特异性siRNA序列干扰Hela细胞内源性线粒体DNA表达，使其内源性ND1基因沉默；经脂质体转入野生型和突变型重组子pcDNA3．1B—NDl，使其在Hela细胞内表达。通过RT—PCR、十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳和荧光显微镜，从mRNA水平→蛋白质水平→线粒体膜电势位检测干扰效果，以筛选有效干扰siRNA序列。结果线粒体ND11和线粒体ND12siRNA序列均具有一定的干扰效果，后者效果明显优于前者；转入3316G→A突变型重组子pcDNA3．1B—ND1的Hela细胞表达的线粒体蛋白低于野生型。结论线粒体DNA的ND1基因正常表达对维持正常的呼吸链功能和细胞增殖至关重要，携有3316G→A突变基因的糖尿病的发病与线粒体蛋白表达下降有关。

摘要：目的探讨1个糖尿病合并无虹膜症家系成员的基因缺陷及其临床特点。方法收集1个糖尿病合并无虹膜症家系的4名患者和2名健康亲属的外周血标本,提取基因组DNA,针对人类配对盒基因（PAX6）4-13外显子设计引物,采用聚合酶链反应结合直接测序法（PCR-Sequencing）分析PAX6基因编码序列有无异常。结果在糖尿病和糖耐量异常合并无虹膜症患者中发现PAX6基因Arg240X杂合无义突变。结论 PAX6基因Arg240X无义突变可能通过影响胰岛素基因的转录,导致胰岛素分泌减少所致的糖代谢异常,同时也可能导致先天性遗传性无虹膜症的发生。

摘要：目的构建一种快速、系统检测与糖尿病相关的45个 mtDNA 位点的膜芯片。方法针对 mtDNA 的45个突变位点,采用 Primer Premier 5.0和 NCBI BLAST 软件设计野生型和突变型探针;将带有8T 长臂的90条探针,通过紫外交联固定于经5×SSC Buffer 处理的尼龙膜;不对称 PCR 方法制备单链靶序列,纯化后经 Biotin 标记,AP-avidin 作用于 NBT/BCIP 显色,目视化观察结果。采用该膜芯片检测24份已知 mtDNA 序列的糖尿病标本,每份标本平行检测3次,评价检测结果。结果 9对引物可在同一条件下特异性扩增45个基因位点的目的片段;野生型和突变型探针的退火温度分别为(59.01±1.42)℃、(59.34±1.29)℃,能够在相同的温度下完成杂交反应;膜芯片样点清晰、规整度好,分布均匀,无漏点和连点,阳性对照和阴性对照结果理想,阴性对照的信号强度与背景持同;除16189位点外,检测结果与 DNA 测序方法有很好的一致性(x^2=113.132,Kappa 值=0.888,P=0.000)。结论成功构建可一次性检测目前国内外报道与糖尿病相关的44个 mtDNA 突变位点的膜芯片,适用于糖尿病患者和高危人群的检测。

摘要：目的应用基因芯片对临床常见的8种致病细菌进行检测。方法选取8种临床常她的致病细菌，包括金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、奇异变形杆菌、产气肠杆菌、荧光假单胞菌、宋内志贺菌。以16SrRNA基因为目的基因，自行设计通片J引物系列扩增目的片段，针埘高变区域设计探针，建立基冈芯片检测体系，并对所选细菌进行检测。收集来自武汉大学中南医院的待检标本50份，包括血液6份、痰液32份、粪便9份、纤维支气管镜检测物3份，提取DNA后利用建立的基因芯片进行检测。结果自行设计的通用引物能很好地扩增目的片段，针对8种细菌进行多批次重复检测，结果显示所选用的探针具有很好的检测效果。对临床50份标本进行检测，其中47份得到准确的检测结果，3份朱得到结果的原因为芯片未包含菌种。通过优化检测过程，可存8h内报告检测结果。探针信引殖时间的衰减程度观察表明，60d后探针信号虽有衰减，但其衰减程度对榆测结果判断无影响。结论本研究设计的基因芯片检测体系能准确而快速地对临床常见细菌做出检测，为基因芯片技术应用于临床奠定基础。

摘要：目的 建立临床常见的病原真菌的基因芯片检测体系.方法 选取8种临床常见真菌,包括白色假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌、热带假丝酵母菌、近平滑假丝酵母菌、土曲霉、黄曲霉、米根霉和烟曲霉.根据真菌ITS区设计引物和探针,进行扩增和芯片制备.通过将待检真菌的PCR产物变性后与点布探针的芯片杂交,观察并分析荧光信号强度,进行对真菌的快速检测.并选取临床真菌阳性标本和细菌阳性标本共25份进行验证.结果 25份临床阳性标本的芯片检测结果显示,10份细菌阳性的标本,经真菌基因芯片检测,全部为阴性,无荧光信号.其余15份真菌标本中,12份临床真菌阳性标本均鉴定出芯片中的某一种真菌的结果.另外采用克柔假丝酵母菌人为制备的3份待检样本,经检测,芯片中8种真菌位点无荧光信号,为阴性,仅有真菌通用探针得到荧光信号,表明该标本中有真菌存在,但无法确认是哪一种.结论 本研究建立的基因芯片可对常见病原真菌进行快速准确的鉴定,为基因芯片应用于临床奠定了基础.

摘要：目的 :建立一种对PON1 192和PON1 5 5位密码子等位基因同步分型的方法。方法 :在Multiplex PCR RELP基础上 ,通过引物设计错配 ,在一体系中同时扩增分别含密码子PON1 192和PON1 5 5的DNA片段 ,当等位基因为PON1 192R/PON1 5 5L时 ,其PCR扩增产物均被引入唯一的限制性内切酶HinfⅠ的识别位点G ANTC。PCR产物经酶消化 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳后 ,根据不同组合片段 ,确认为不同的基因型 ,从而同时对两个位点进行基因分型。结果 :在检测的 80例健康个体中PON1 192 :Q 4 6 .9% ,R 5 3.1% ;PON1 5 5 :L 95 .6 % ,M 4 .4 % .结论 :此方法同时可分析基因两个位点的多态性 ,省时省力 ,方法简便 ,便于两个位点以及与疾病之间的连锁分析 ,很有推广价值 .

摘要：目的建立一种能快速鏊定临床常见8种深部真菌的DNA微阵列。方法选取临床常见的8种真菌，包括白色假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、近平滑假丝酵母、土曲霉、黄曲霉、烟曲霉和米根霉。利用通用引物扩增真菌ITS区，生物素标记目的基因。针对扩增靶序列的可变区段设计探针，以尼龙膜为载体，建立DNA微阵列。采用所建立的DNA微阵列对45株临床真菌分离株进行检测。结果应用DNA微阵列技术成功地对8种临床常见真菌菌种进行了检测，检测时间可缩短至8h。白色假丝酵母、光滑假丝酵母、热带假丝酵母、近平滑假丝酵母、米根霉、黄曲霉以及土由霉的探针的检测特异度高，无非特异性反应；烟曲霉的检测探针与黄曲霉之间有微弱非特异性反应，但是不影响鉴定结果。45例临床真菌分离株的DNA微阵列鉴定结果与临床检出结果完全一致。结论该研究建立的DNA微阵列技术可在8h内快速、准确地检测临床常见深部感染真菌菌种，具备应用于临床辅助诊断的前景。

摘要：目的建立一种人芳香二烷基磷酸酯酶(PON)基因丛等位基因快速分型法。方法在Multiplex-PCR-RELP基础上,通过引物设计错配,在一体系中同时扩增分别含PON1-192、PON1-55和PON2-311位密码子的DNA片段,当等位基因为PON1-192R/PON1-55L/PON2-311S时,PCR扩增产物中均被引入唯一的限制性内切酶HinfⅠ的识别位点G*ANTC。PCR扩增产物经酶消化,聚丙烯酰胺凝胶电泳后,相互分开的不同组合的片段,确认为不同的基因型组合,同时对3个位点进行基因分型。结果在检测的80例健康个体中,等位基因频率为PON1-192:Q 46.9%,R 53.1%;PON1-55:L 95.6%,M 4.4%;PON2-311:S 78.8%,C 21.2%。结论此方法快速分析3个位点的基因多态性,省时省力、节约经费,便于3个位点之间的连锁分析,具有推广价值。

摘要：目的对一个四代常染色体显性遗传视网膜色素变性家系进行突变基因的筛查。方法选取了常见的11个视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）相关致病基因：视紫红质（rhodopsin，RHO，RP4）基因、视网膜变性慢蛋白（peripherin 2／retinal degeneration slow PRPH2／RDS，RP7）基因、视网膜色素变性1（retinitis pigmentosa 1，RP1）基因、前体mRNA处理因子31（pre—mRNA processing factor31，PRPF31，RP11）基因、次黄苷单磷酸脱氢酶1型（inosine monophosphate dehydrogenase 1，IMPDH1，RP10）基因、视杆外节蛋白1（rod outer segment protein 1，ROM1）基因、神经视网膜亮氨酸拉链（neural retina leucine zipper，NRL，RP27）基因、Pim1激酶相关蛋白1（piml—kinase associated protein1，PAP1，RP9）基因、视锥-视杆同源盒（cone—rod homeobox—containing，CRX）基因、前体mRNA处理因子3（pre—mRNA processing factor3，PRPF3，RP18）基因、前体mRNA处理因子8（pre—mRNA processing factor 8，PRPF8，RP13）基因。通过聚合酶链式反应扩增这11个RP相关致病基因的外显子和邻近拼接位点，扩增产物进行正、反双向测序。结果①对常见的11个RP相关致病基因的64个片段的研究显示，除了基因多态性和内含子的变异外，未发现与疾病有关的外显子或邻近拼接住点的突变。②首次在中国人种中发现RP9基因的c．629A→G，（Lys210Arg）变异。结论该文设计研究的突变基因未被检测到，表明此家系在11个RP相关致病基因的外显子和邻近拼接位点无基因突变。

摘要：目的:设计一个从斑马鱼胚胎得到大量完整高纯度心脏的新方法,从而用于测定早期心脏的基因表达。方法:收集上百颗心肌特异表达绿色荧光(cmlc2-GFP)的转基因斑马鱼的胚胎放入冰浴的10%胎牛血清L-15培养基中,用一个5 m L注射器反复抽吸迫使胚胎卵黄囊和心包腔破裂,在荧光显微镜下用微量毛细吸管收集游离的心脏,同时用单独的EP管收集身体组织,最后用荧光定量PCR技术(RT-PCR)验证提纯心脏组织的生物活性和特异性。结果:提取的大部分胚胎心脏的形态是完整的,约200颗胚胎心脏中提取了300 ng总RNA。提纯的活性心脏组织不仅高表达心脏特异性基因(cmlc2,myh6),而且几乎不表达非心脏组织的特异基因(six3b,ifabp)。结论:利用这个简便方法富集和提纯斑马鱼胚胎心脏可以得到高度纯化并具有生物活性的心脏组织。