摘要：本研究构建丙型肝炎病毒(HCV)糖蛋白E2的N-糖基化位点定点突变体。采用高保真性的PfxDNA聚合酶设计两对引物分别引入两个突变位点通过PCR体外定点突变使E2第535、583位核苷酸由A突变为T从而使AAC编码的天冬酰氨突变为TAC编码的酪氨酸,使得N-糖苷化位点NNT、NST突变为YNT、YST。结果得到两个单位点以及一个双位点突变体,并将突变型E2连接到真核表达载体pcDNA3.1-/Myc-HisB上。成功获得的3个HCVE2糖蛋白糖基化位点定点突变体,为进一步进行HCVE2糖蛋白糖基化位点与分子伴侣之间的相互关系以及突变体对机体的免疫功能的影响的研究奠定了基础。

摘要：目的应用指数级富集配体系统进化技术(system evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选与鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)特异性结合的ssDNA适配子,建立酶联寡聚核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)检测鸟分枝杆菌的方法。方法设计并合成随机序列ssDNA文库,以鸟分枝杆菌为靶标,利用SELEX技术筛选特异性的ssDNA适配子,将亲和力最高的适配子进行克隆、测序;用DNAMAN软件分析适配子的二级结构,并检测其特异性。结果单适配子N1与鸟分枝杆菌结合的Kd为(246±21.87)nmol/L,即亲和力最高,而对结核分枝杆菌等其他分枝杆菌亲和力较低。结论应用SELEX筛选的鸟分枝杆菌ssDNA适配子N1具有较高亲和力和特异性,可作为鸟分枝杆菌检测及艾滋病合并鸟分枝杆菌感染的特异性诊断制剂。

摘要：目的应用CS-SELEX(cell surface-system evolution of ligands by exponential enrichment)技术筛选与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)非结构蛋白4B(non protein 4B,NS4B)特异性结合的ssDNA适配子,建立检测HCV NS4B的酶联寡聚核苷酸吸附试验(enzyme-linked oligonucleotide assay,ELONA)方法。方法构建pDisplay-NS4B质粒,并转染至HepG2细胞中,在G418存在情况下连续筛选1个月,得到单克隆细胞群,经过Western blot以及流式细胞术验证,获得稳定表达NS4B的HepG2细胞。设计并合成随机序列ssDNA文库,以稳定表达NS4B的细胞为正向筛选靶细胞,以HepG2细胞为反筛细胞进行CS-SELEX技术筛选。每轮筛选获得的具有结合NS4B能力的ssDNA适配子,通过PCR扩增得到富集,随后通过不对称PCR获得下一轮筛选的ssDNA文库。经过16轮筛选,将亲和力最高的筛选产物克隆并测序,用ELONA方法检测适配子的亲和力。结果成功构建表面展示表达重组质粒pDisplay-NS4B。分别将该质粒转入HepG2细胞,通过G418筛选获得稳定表达HCV-NS4B的细胞系NS4B-HepG2。对CS-SELEX筛选的各轮适配子库进行亲和力测定,其中第14轮库适配子与NS4B的亲合力最高。分别对第14轮库中的单个适配子进行亲和力测定,以适配子ZN1和ZN5与NS4B的亲合力最高。ZN1和ZN5不仅能结合展示在细胞表面的NS4B蛋白,还能结合丙型肝炎病毒感染细胞(HCV cell culture,HCVcc)中的HCV-NS4B蛋白。结论适配子ZN1和ZN5对NS4B有高亲和力,这对研究HCV-NS4B致癌机制、HCV诊断以及治疗方面有潜在的应用价值。

摘要：RNA干扰已成为当前肿瘤基因治疗的新策略，我们设计了针对血管内皮生长因子（VEGF）短发夹RNA（shRNA），观察其对人胃癌细胞血管VEGF表达的影响。