摘要：目的探讨Leber遗传性视神经病变(LHON)患者接受基因治疗后视功能恢复与视网膜神经纤维层(RNFL)厚度变化之间的关联。方法采用多中心非随机单臂临床试验设计,于2017年12月至2018年12月在华中科技大学同济医学院附属同济医院、十堰市太和医院及武汉大学附属鄂州市中心医院纳入LHON患者159例,所有患眼均接受重组腺相关病毒2-还原型辅酶Ⅰ脱氢酶4(rAAV2-ND4)0.05μl玻璃体腔注射,于术前及术后1、3、6、12个月进行随访;采用标准对数视力表检查患眼最佳矫正视力(BCVA)(转换为LogMAR视力);采用Humphrey自动视野计测定患眼视野指数(VFI)和平均偏差(MD);采用Spectralis?HRA+OCT仪测量患眼视盘上方、下方、颞侧、鼻侧和平均RNFL厚度。以术后第12个月BCVA、视野和RNFL厚度作为治疗的主要结局。依据治疗后12个月BCVA改善情况将患者分为注射眼视力改善组81眼、注射眼视力未改善组62眼、未注射眼视力改善组65眼和未注射眼视力未改善组78眼;依据术后第12个月VFI改善情况将患者分为注射眼VFI改善组48眼、注射眼VFI未改善组71眼、未注射眼VFI改善组47眼和未注射眼VFI未改善组72眼,依据MD改善情况分为注射眼MD改善组52眼、注射眼MD未改善组67眼、未注射眼MD改善组47眼和未注射眼MD未改善组72眼。采用Pearson线性回归法分析各组患眼BCVA、VFI和MD恢复情况与RNFL厚度之间的关联。结果治疗后12个月,注射眼和未注射眼BCVA(LogMAR视力)分别为1.37±0.55和1.29±0.59,分别优于注射前的1.70±0.41和1.53±0.51,差异均有统计学意义(t=4.920、3.550,均P<0.001)。治疗后12个月注射眼VFI较治疗前明显改善,MD明显下降,差异均有统计学意义(均P<0.001);未注射眼VFI较治疗前明显提高,MD有所下降,差异均有统计学意义(均P<0.01)。治疗后RNFL厚度总体逐渐变薄。注射眼视力提高组BCVA与视网膜上方、下方、鼻侧、平均RNFL厚度均呈负相关(r=-0.362、-0.292、-0.307、-0.308,均P<0.05)。注射眼VFI提高组VFI与上方、下方、鼻侧、平均RNFL厚度均呈正相关(r=0.439、0.356、0.294、0.401,均P<0.05)。注射眼MD提高组MD与上方、下方、鼻侧、平均RNFL厚度均呈正相关(r=0.495、0.424、0.377、0.474,均P<0.05)。结论LHON患者基因治疗后RNFL厚度与视功能恢复程度有明显关联,RNFL较厚眼视功能恢复较好。

摘要：背景:研究表明,亚低温和适当升压对脑缺血都有一定的保护作用,二者联合应用可能产生协同作用,起到更好的脑保护效果。目的:通过升压联合亚低温对大鼠局灶性脑缺血再灌注后脑梗死体积、血脑屏障的影响,探讨脑保护作用机制。设计:以实验动物为研究对象,完全随机对照设计。单位:两所大学医院的神经科和一所市级医院的皮肤科。材料:实验于2001-03/07在华中科技大学同济医学院附属协和医院神经科实验室和武汉大学人民医院神经科实验室完成。选择64只成年Wistar大鼠由武汉大学人民医院实验动物中心提供。干预:制备大鼠局灶性脑缺血模型,随机分为对照组、升压组、亚低温组及升压联合亚低温治疗组(联合组),每组16只动物,缺血3h再灌注;对照组常温不予处理,升压组缺血2h给予升压处理3h,亚低温组缺血2h开始亚低温干预,联合组联合应用亚低温组和升压组治疗方法。缺血24h处死动物。主要观察指标:神经功能缺失评分、脑梗死体积和血脑屏障破坏情况。结果:升压组、亚低温组及联合组的神经功能缺失评分分别为(2.12±0.54)分、(2.14±0.69)分、(1.78±0.61)分,脑梗死体积分别为(17.65±4.78)%,(16.21±3.79)%,(11.31±3.64)%,Even's蓝染色体积分别为(56.63±10.70)mm3,(53.52±8.44)mm3,(38.45±5.25)mm3均明显低于对照组?

摘要：目的:重组构建抑制多药耐药MDR1基因表达的shRNA真核表达载体,研究其对肝癌耐药细胞MDR1基因表达的抑制作用,以及对P-糖蛋白(P-gp)表达和功能的抑制作用.方法:根据MDR1基因序列,设计两段21个碱基的MDR1特异性靶序列作为shRNA目标序列(sh-MDR1-1,sh-MDR1-2),重组构建psh-MDR1表达质粒.采用脂质体介导转染肝癌耐药细胞SMMC-7721/R,用MTT法测定细胞对化疗药物阿霉素(ADM)的敏感性,流式细胞仪检测细胞膜表面P-糖蛋白(P-gp)表达和细胞内Rhdaming123(Rh123)的潴留.结果:PCR和DNA测序证实了psh-MDR1-1和psh-MDR1-2重组质粒的成功构建,均能有效地抑制细胞P-gp表达;转染细胞后均能够一定程度地恢复耐药细胞对化疗药物ADM敏感性,P-gp表达水平明显降低,细胞内的Rh123稳态积累量均明显增高;第1条序列更能有效的抑制MDR1基因表达.结论:体外完成shRNA RNAi载体的构建,能有效地逆转肝癌耐药细胞MDR1基因过度表达,抑制P-gp介导的多药耐药.从DNA载体产生的shRNA在肝癌耐药细胞内能诱导RNAi,能够序列特异性地抑制MDR1基因表达.

摘要：背景:胆固醇可使体外培养的神经元自身突触数量增加,囊泡数量及递质释放效能亦明显增高。目的:建立大鼠脑海马组织中微量胆固醇的高效液相色谱检测方法,观察胆固醇在大鼠脑海马发育和成熟中的作用。设计:重复测量实验。材料:实验于2004-01/06在武汉大学人民医院神经科学研究室完成。选择健康雄性Wistar乳鼠(出生24h内)、幼鼠(28～30d,体质量40～60g)和成鼠(90～100d,体质量200～250g)各10只。方法:大鼠在麻醉状态下断头取海马称重,制备匀浆,离心,过滤后采用美国安捷伦公司反相色谱柱(ZORBAXXDBC184.6250mm5μm,Agilent),以乙腈-异丙醇(4∶1)为流动相;流速0.8mL/min;检测波长208nm。VARIANProstar325紫外检测器和美国VARIAN公司的LCWORKSTATIONV6.2色谱数据处理系统检测和处理色谱数据,获得胆固醇色谱图。样品中胆固醇含量(mg/g)=10×0.9965×样品中胆固醇的峰面积×标准胆固醇的含量(g/L)÷标准胆固醇的峰面积主要观察指标:①乳鼠、幼鼠和成鼠脑海马胆固醇含量与其色谱峰面积的关系。②乳鼠、幼鼠和成鼠脑海马胆固醇含量。结果:30只大鼠均进入结果分析。①胆固醇含量在0.1323～2.6472g/L时与其色谱峰面积呈良好的线性关系(r=0.99993)。②乳鼠、幼鼠和成鼠脑海马胆固醇含量:3组样品的胆固醇含量分别为(2.92±0.03),(11.20±3.41),(12.91±1.25)mg/g,差别均有极显著性意义(P<0.01)。结论:用高效液相色谱法检测大鼠脑海马组织中的微量胆固醇灵敏,特异性好,且分析时间短。在大鼠发育过程中,脑海马中胆固醇含量渐增,说明胆固醇对大鼠脑海马结构、功能的发育和成熟可能发挥了关键性的作用。

摘要：背景:约1/3的脑损害患者存在不同程度的语言功能受损或丧失,其中大部分存在不同程度的语法缺失。目前,关于汉语语法加工究竟由左半球或右半球还是两半球共同参与完成的尚不清楚。目的:探讨脑卒中后汉语语法缺失与脑损害区域的关系,为脑卒中后汉语语法缺失患者的语言康复提供理论依据。设计:病例-对照分析。对象:收集2001-10/2002-08武汉大学附属人民医院住院的脑卒中患者60例,所有患者均首次发病,经颅脑CT检查证实为左或右半球单发病灶。根据病灶所在侧分为左半球脑卒中组和右半球脑卒中组各30例。正常对照组为30名既往无脑器质性疾病史和神经系统症状、体征的健康志愿者。方法:先用标准汉语失语检查法检查语言,初步确定有无语法障碍;然后应用汉语语法量表(包括词类、语序、语用、句子-图画匹配、语言符号操作等)对3组被试者进行测试,利用统计学结果分析汉语语法缺失与CT所示脑损害区域的关系及意义。应用计算机图像处理技术对20例汉语语法缺失患者的颅脑CT图像进行标准化处理,观察病变的集中趋势。主要观察指标:①汉语语法量表评估结果。②CT图像标准化处理结果。结果:按意向处理分析,90名被试者全部进入结果分析。①汉语语法量表评估结果:左半球脑卒中组患者的词类、语序、语用、句图匹配和语言符号操作评分显著低于右半球卒中组和正常对照组(P0.05)。②CT图像标准化处理后,病变部位主要集中在左额叶和左颞叶。结论:左额-颞叶神经网络系统损伤与汉语语法缺失密切相关,右额-颞叶神经网络系统参与句法辅助加工,完整的汉语语法认知需要大脑两半球的协同活动。

摘要：背景:星状神经节阻滞可改善脑循环,调节免疫,降低血浆儿茶酚胺浓度,白细胞介素6是机体急性应激反应中最敏感重要的标志和介导物之一,在脑缺血性损伤中扮演着神经保护和神经毒性的双重作用。目的:观察星状神经节阻滞对家兔全脑缺血再灌注期间血清白细胞介素6含量的影响,探讨星状神经节阻滞对全脑缺血再灌注损伤的作用效应。设计:随机对照的动物实验。单位:郧阳医学院附属太和医院麻醉科、郧阳医学院附属人民医院麻醉科。材料:实验于2003-03在郧阳医学院实验中心及附属太和医院神经科学研究所进行动物实验,白细胞介素6检测试剂盒及测定工作由中国人民解放军总医院放射免疫研究所提供和协助完成。选择健康日本大耳白免28只,雌雄不拘,随机分成星状神经节组、盐水对照组、空白对照组和假手术组,每组7只。方法:用手术法在所有动物星状神经节旁置入一导管,用六血管阻断法制作全脑缺血再灌注模型,星状神经节阻滞组在缺血15min后松开动脉夹再灌注开始,同时从导管持续泵入2.5g/L的布比卡因行左侧星状神经节阻滞,生理盐水对照组和空白对照组分别在松开动脉夹时从导管泵入生理盐水代替布比卡因和不用药,假手术组仅完成相应的手术操作而不夹闭动脉。采用放射免疫法测定缺血前、再灌注10min,4,10,20及30时血清白细胞介素6的水平。主要观察指标:各组实验动物在再灌注后各时点白细胞介素6水平变化。结果:纳入本次实验的28只大耳白兔全部进入结果分析。白细胞介素6在各组均呈上升趋势,星状神经节阻滞组仅在再灌注30h时高于假手术组,差异有显著性[(321±52)和(299±45)ng/L,P0.05);生理盐水对照组和空白对照组白细胞介素6水平在再灌注4～30h时均高于假手术组,在再灌注10h以后高于星状神经节阻滞组,差异均有显著性(P均<0.05)。星状神经节阻滞组白细胞介素6升高的水平较生理盐水对照组、空白对照组显著降低(P<0.05)。结论:星状神经节阻滞可明显降低家兔全脑缺血再灌注期间血清白细胞介素6的水平,提示星状神经节阻滞对全脑缺血再灌注损伤具有一定的保护和治疗作用,可作为治疗脑缺血再灌注损伤的一种新的途径。

摘要：背景:动物和人外周血中分离出的间充质干细胞生长繁殖受分离方法、培养条件等因素的影响。目的:采用重组人粒细胞集落刺激因子动员小鼠外周血间充质干细胞,体外培养条件中加入鼠尾胶包被,观察其对细胞分离、培养、增殖的影响。设计、时间及地点:开放性实验,于2005-05/2007-12在郧阳医学院附属人民医院临床医学研究所完成。材料:昆明小鼠20只随机分为鼠尾胶包被组和不包被对照组,每组10只。方法:小鼠皮下注射重组人粒细胞集落刺激因子80μg/(kg·d)连续动员5d,最后一次注射后6h取外周血。肝素抗凝后,采用全血细胞分离培养,用含体积分数为0.15胎牛血清DMEM培养基,分别接种于包被和未包被鼠尾胶的12孔板,接种密度为1×105/孔,48h后半量换液以后每3天换液1次,培养10d。主要观察指标:①鼠尾胶包被的培养板对形成成纤维样细胞集落的影响。②成纤维样细胞集落中的间充质干细胞表面标记流式检测结果。③成纤维样细胞集落成骨、成脂肪诱导后嗜银法和油红O法染色鉴定。结果:①使用鼠尾胶包被的培养板可增加重组人粒细胞集落刺激因子动员后外周血成纤维样细胞集落出现的频率(P<0.05)。②经流式细胞术鉴定形成成纤维样细胞集落的细胞不表达CD34、CD133,表达CD90、CD105。③成骨、成脂肪诱导后细胞嗜银法和油红O法染色鉴定均呈阳性。结论:培养的细胞符合公认间充质干细胞的特征,鼠尾胶可增加培养皿的黏附性促进间充质干细胞分离。

摘要：目的 运用规律成簇的间隔短回文重复（CRISPR）/Cas9基因编辑技术构建敲除趋化因子受体4 （CXCR4）基因的人脑胶质瘤U251细胞.方法 设计3对针对目标基因CXCR4的导向RNA（sgRNA）,通过PX335质粒构建3组该基因的Cas9表达载体（CXCR4-sgRNA-1、CXCR4-sgRNA-2、CXCR4-sgRNA-3）,测序验证后,将构建正确的载体CXCR4-sgRNA-1转染进至U251细胞,T7核酸内切酶Ⅰ （T7E1）酶切鉴定敲除效率,分离单克隆细胞5组进行培养,分别测序及蛋白印迹法鉴定其敲除效率和蛋白含量,获得稳定敲除阳性单克隆细胞.结果 测序验证CXCR4-sgRNA-1组载体构建成功,转染载体后U251细胞经聚合酶联反应（PCR）酶切鉴定敲除效率为48％,其2、3、4、5号单克隆细胞敲除效率分别为20％、40％、30％、20％.PCR产物连接T载体后测序,结果显示3组出现点突变,2号为A突变为G,4号为T突变为C和5号为A突变为G,而3号单克隆敲入38 bp碱基,确定为有意义的突变.2、3、4号单克隆细胞CXCR4蛋白表达量为0,敲除组CXCR4蛋白相对表达量较对照组明显降低（0比0.746±0.010,P=0.000）,差异有统计学意义.免疫印迹结果说明敲除CXCR4基因的U251细胞株内无CXCR4蛋白的表达;测序比对得到有效的敲除细胞株.结论 通过CRISPR/Cas9系统高效地获得了靶向CXCR4重组质粒,并且筛选出稳定敲除CXCR4表达的U251细胞株.

摘要：梳理中国儿童抗菌药物使用管理进展,探讨顶层设计、多学科协作、抗菌药物管理的具体专项要求,以及评价体系建立中的难点,并思考应对策略,为进一步完善中国儿童抗菌药物使用管理相关策略,提升遏制细菌耐药治理效能提供参考和借鉴。

摘要：目的:构建lefty1基因与pcDNA3.1(+)相融合的真核表达载体,并在lefty1基因的下游加上Flag标签,转染人肾小管上皮细胞株验证重组质粒活性。方法:设计并合成lefty1基因上下游引物,同时加上Flag标签序列,PCR扩增基因,并将其连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,双酶切图谱分析和扩增产物测序鉴定所构建的真核表达载体。脂质体转染法将重组质粒pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag和pcDNA3.1(+)分别转染至人肾小管上皮细胞株HK-2,qPCR和Western blot检测lefty1在mRNA和蛋白水平的表达。结果:以lefty1基因质粒模板扩增得到的片段约1 150bp,双酶切得到目的基因片段,测序的结果显示与lefty1基因序列相同。转染肾小管上皮细胞后,pcDNA3.1(+)-lefty1-Flag能表达lefty1蛋白。结论:成功构建lefty1基因真核表达载体,为一步研究lefty1基因功能奠定了基础。