摘要：【目的】构建包装NSPc1-si RNA慢病毒颗粒,并在U87胶质瘤细胞中鉴定其感染及基因沉默效果。【方法】根据Gen Bank中基因信息,采用干扰序列设计软件设计靶点,制备合成GV118-si RNA目的质粒,转化感受态细胞,对于长出的克隆应用菌落PCR鉴定,再对PCR鉴定阳性的克隆进行测序和对比分析,重组病毒质粒与另外2种辅助包装载体质粒通过Lipofectamine TM2 000共转染293T细胞,培养48 h后,收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度;并检测病毒颗粒在目的细胞U87胶质瘤细胞中的感染效率,实时荧光定量PCR(RT-PCR)和Western blotting方法检测NSPc1 si RNA慢病毒对U87中NSPc1的干扰作用。【结果】成功构建NSPc1 si RNA慢病毒载体GV118-si RNA,重组病毒滴度为4×108TU/ml;用该病毒体外感染U87胶质瘤细胞,当感染复数(MOI)为10时,感染效率大于90%;RT-PCR和Western blotting方法检测NSPc1基因沉默的效率分别为66.4%、60.0%。【结论】成功构建了NSPc1 si RNA慢病毒载体GV118-si RNA,该重组病毒包装后在体外感染U87胶质瘤细胞的效率较高,且具有显著的基因沉默效果。

摘要：目的利用RNA干扰技术,以信号转导和转录激活因子3(STAT3)为靶基因,设计构建重组体,并进行序列分析鉴定。方法设计一条有小发夹结构的DNA序列,聚合酶链反应(PCR)扩增合成siRNA表达框架(SECs)表达框架,克隆至载体psi Lent GeneTM中构建重组体,转化*** DH5α菌株,提取质粒进行酶切鉴定后测序分析。结果重组质粒经EcoRⅤ酶切、电泳、测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功。结论成功构建了STAT3靶向RNA干扰重组体,为肿瘤的基因治疗在分子水平、细胞水平和整体水平的研究提供一些新方法。