摘要：目的:研究人肝脏中辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)及其选择性剪接体NRDR iso的生物学功能。方法:在BL21-AI菌中进行NRDR和NRDR iso表达,分离溶解包涵体。应用部分析因设计方法设计复性基质,并进行筛选。应用固相金属离子亲合层析技术(IMAC)和筛选出来的复性基质对变性的NRDR和NRDR iso进行复性和纯化。高效分子筛色谱分析复性后NRDR和NRDR iso的纯度及相对分子质量。高效反相液相色谱确定视黄醛还原酶活性,双倒数法测定酶促反应的Km和Vm ax。结果:NRDR和NRDR iso在BL21-AI菌中进行了高效表达,每毫升培养物可获得湿重为3.3 mg和1.2 mg的包涵体。经筛选确定4℃,225 mmol/L NaC l,25 mmol/L KC l,10%甘油,1%蔗糖,50 mmol/L Tris-HC l,pH 8.5为最适复性基质。应用IMAC复性后,高效分子筛色谱分析表明NRDR和NRDR iso得到较好的复性,相对分子质量分别为31.57×103和20.46×103。NRDR具有视黄醛还原酶活性,其催化酶促反应的Km和Vm ax分别为(2.7±0.18)μmol/L和(0.357±0.047)μmol/(mg.m in)。NRDR iso未检测到视黄醛还原酶活性。结论:建立了对NRDR和NRDR iso变性蛋白进行复性方法,确定NRDR具有辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶活性,NRDR iso生物学功能有待进一步研究。

摘要：从牛的肝脏中快速抽提总RNA ,根据GenBank已发表NADP(H) 依赖的视黄醇脱氢酶基因 (NRDR)的cDNA序列 ,设计并合成特异引物 ,利用cDNA末端快速扩增 (RACE)方法和反转录 聚合酶链式反应 (RT PCR) ,得到牛肝内的NRDRcDNA的全长序列。经测序证实 ,牛肝NRDR的全长cDNA序列为 12 6 6bp ,其开放读码框架在 2 4～ 80 6bp ,编码 2 6 0个氨基酸 (GenBank登录号 :AF4 874 5 4 )。根据NRDR基因推导出的氨基酸序列与人、鼠、兔有高度同源性 ,并含有SDR超家族成员的两个高度保守的模序 ,在其C 端含有过氧化物酶体的靶向序列为SHL。结果表明 ,牛的NRDR应属于过氧化物酶体内SDR超家族成员并在维甲酸合成的限速步骤起作用的酶 ,也为维甲酸合成的传统通路提供一个补充。

摘要：目的 :建立实时定量聚合酶链反应 (RQ PCR)检测心血管活性多肽的方法 ,为快速、准确地分析心脏组织中apelin基因表达奠定基础。方法 :根据心血管活性多肽apelin基因序列 ,设计并合成引物和荧光标记TaqMan探针。将逆转录 聚合酶链式反应扩增的apelin基因片段克隆至pGEM Teasy载体 ,重组质粒经蓝白筛选、酶切、测序鉴定后 ,作为阳性克隆标准品 ,用于标准曲线的制定 ,由此可定量检测出每一样品模板的起始拷贝数。结果 :阳性克隆标准品制作的标准曲线可显示循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系 (r =0 970 ) ,可用于apelin基因表达的起始拷贝数定量测定。结论 :RQ PCR方法较常规PCR技术更为简便、准确、特异、灵敏 。

摘要：目的构建人DNMT3B7真核表达载体pCMV-DNMT3B7。方法据Genebank中人DNMT3B7cDNA序列设计并合成特异性引物,以人DNMT3B1为模板,利用PCR技术扩增出DNMT3B7,并将扩增产物克隆到真核表达载体pCMV-2B中。结果 PCR扩增得到人DNMT3B7的cDNA片段大小为1.1kb,重组子利用限制性内切酶进行酶切、PCR鉴定和DNA序列分析得到真核表达载体pCMV-DNMT3B7。结论成功构建了人DNMT3B7真核表达载体,为进一步研究DNMT3B异构体提供了条件。