摘要：挖掘功能基因,提升菌株环境胁迫耐受性,对高效利用纤维素水解液产乙醇至关重要。产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)是具有多重抗逆性的工业菌株,经基因组文库筛选,获得能够提高酵母乙酸耐受性的rRNA甲基转移酶基因CgBmt5。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达CgBmt5提高了乙酸耐受性,重组菌在胁迫下乙醇产量为60.5 g/L,提高17.7%。在***中过表达CgBmt5后,乙酸胁迫下乙醇产量提高17.6%,2种过表达的单位菌体产量、底物转化率、生产强度均有提高。进一步将***过表达菌应用于纤维素水解液发酵,乙醇产量提高71.7%,转化率提高65.0%,生产强度提高155.7%。乙酸胁迫下,过表达菌中脂质过氧化水平降低,且过氧化氢酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性增加;转录分析发现,Pfk1和Arg3基因上调,Gpd1和Cox3下调,表明CgBmt5可能通过降低脂质过氧化水平、提高SOD和CAT活性及影响糖代谢和精氨酸合成促进菌株的乙酸耐受和胁迫下的发酵能力。该研究为酵母的胁迫耐受机制和纤维素乙醇技术发展提供了新的生物材料。

摘要：工业发酵和纤维素乙醇生产过程存在多重环境胁迫,提高菌株耐受性对发酵生产十分重要.通过敲除和RNA干扰研究产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)蛋氨酸补救途径基因CgE1对***表型的影响,并将其在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中过表达,应用于乙醇发酵.结果显示,敲除CgE1无法获得转化子.干扰CgE1表达使***的乙酸、H_(2)O_(2)和高温耐受性降低,但对其低温、高糖和高盐耐受无影响.过表达CgE1使重组***的乙酸、H_(2)O_(2)和高温耐受性提高.高温下,重组***乙醇产量为30.5 g/L,提高10.5%,16 h时生产强度提高28.6%;乙酸胁迫下,乙醇产量为35.1 g/L,提高9.0%,36 h时生产强度提高4.4倍;过氧化氢胁迫下乙醇产量为36.5 g/L,提高9.6%,60 h时生产强度提高33.1%;在未脱毒纤维素水解液中,乙醇产量为15.2 g/L,提高22.6%,单位菌体产量提高18.3%,30 h时生产强度提高23.1%.此外,干扰表达的***和过表达的***在胁迫下的细胞膜脂质过氧化水平都发生明显变化.过表达菌株在胁迫条件下胞内蛋氨酸含量增加.本研究表明CgE1是***生长必需基因,通过调控细胞膜脂质过氧化水平和调节胞内蛋氨酸水平提高***和重组***的乙酸、H_(2)O_(2)和高温耐受性,并能增强重组***在高温胁迫下和未脱毒纤维素水解液中的乙醇发酵性能.

摘要：【背景】咖啡酸(3,4-二羟基肉桂酸)是一种有多种生物活性和药用价值的天然酚类化合物,产甘油假丝酵母(Candida glycerinogenes)具有咖啡酸前体代谢途径,高耐酸且生长与发酵速率快,是潜在高产咖啡酸的底盘细胞,但无游离载体将影响咖啡酸合成的深入研究。【目的】探索在无天然游离质粒的***中构建操作更简便、表达能力更强的游离载体合成咖啡酸的可行性。【方法】筛选自主复制序列(autonomously replicating sequence,ARS),构建适用于***合成咖啡酸的游离载体,并通过改造其ARS位置、标记基因URA5启动子长度、基因表达元件和利用Kozak序列优化表达并合成咖啡酸。【结果】构建的5个分别含不同ARS的载体中,pTGAPU-CA-AOX1t-KLARS在***中能自我复制并表达合成咖啡酸的基因,而且当ARS位于目的基因表达元件上游、URA5启动子截短250 bp,或分别采用Kozak序列与终止子URA5t后,咖啡酸产量较改造前均有明显提升,最高产量为初始产量的3.73倍,达29.1 mg/L,高于前期整合表达产量。【结论】在***中非整合表达合成咖啡酸且优于整合表达,为今后利用游离载体改造咖啡酸合成代谢途径提供了新工具,同时为其他无游离质粒菌株构建非整合表达体系提供参考。

摘要：针对生物脱硫污泥中单质硫回收困难的问题,以生物脱硫系统产生的污泥为实验对象,研究了生物硫污泥的特性。经过测定得到了如下结果:生物脱硫污泥中单质硫的含量为51.2%,蛋白质5%、Na^+8.32%、Ka^+7.47%、Mg^(2+)4.82%、SO_4^(2-)10.5%、Cl^-4.45%和灰分8.24%,单质硫被带电聚合物所包裹。根据污泥的特性,设计了一套高温溶解-低温析出的单质硫回收工艺。生物硫污泥和萃取剂(甲苯/四氯乙烯=5/95)在80℃下萃取30 min,萃取剂的用量为20 m L/g生物硫污泥,萃取完成后高温过滤,滤液在4℃下过夜保存,再次过滤析出的单质硫晶体。单质硫的回收率为91.2%,析出的单质硫纯度可达98%,可以直接用于其他工业。萃取剂重复使用5次后单质硫的回收率仍可达到79.6%。结果表明,高温溶解-低温析出法可有效从含硫化合物产生的生物硫污泥中提取单质硫。

摘要：【目的】针对嗜酸硫杆菌极端特殊的生化特性,分别建立双层平板培养高效筛选方法和补料分批高密度发酵策略,并优选最佳保藏方法,以强化对该类菌种资源的利用和储备效率。【方法】分别采用以异养型微生物Sacchromyces ellipsoideu和Rhodotorula sp.为底层培养物的双层平板培养嗜酸硫杆菌,并结合透射电子显微镜技术(TEM)考察细胞形态差异。结合硫化矿培养基设计及单质硫补料培养策略,延长Acidithiobacillus thiooxidans对数期,提高比生长速率。分析不同保藏方法对嗜酸硫杆菌细胞存活率的影响。【结果】采用异养微生物——Rhodotorula sp.作为底层培养物的双层平板培养法在缩减1/3检出周期的同时将Acidithiobacillus ferrooxidans和Acidithiobacillus thiooxidans的检出率提高了3倍左右。TEM结果表明双层培养中细胞形态更为规则。采用基于Starkey-硫化矿培养基的补料分批发酵策略提高了Acidithiobacillus thiooxidans平均比生长速率,硫对生物量转化率和生产强度分别比分批培养提高31.1%和187.9%。4°C低温保藏方式更适于嗜酸硫杆菌的保藏,有效保藏期1–3月。【结论】Rhodotorula sp.为辅助培养物的双层平板培养法可有效提高嗜酸硫杆菌的筛选效率。设计的Starkey-硫化矿培养基结合补料分批培养策略可实现Acidithiobacillus thiooxidans高密度培养。简单高效的4°C低温保藏方式更适合于嗜酸硫杆菌的中短期保藏。

摘要：【目的】筛选具有较强脱氮除磷能力的细菌,建立结合S1酶保护分析的分子探针技术,以分析该菌在发酵过程中的数量变化情况。【方法】采用缺磷培养基厌氧培养、富磷培养基好氧培养和硝酸盐还原产气实验进行脱氮除磷菌筛选。通过16S rRNA基因序列分析及同源性比对,结合菌株的生理生化鉴定试验,鉴定筛选株。设计相应的16S rRNA探针组,建立结合S1酶保护分析的分子探针技术。【结果】筛选的菌株被鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.,命名为LY10。菌株LY10在富磷培养基中好氧培养24 h,总磷去除率达90.01%。在反硝化聚磷培养基中培养48 h,总氮和总磷去除率分别为84.71%和89.37%。针对假单胞菌16S rRNA基因序列设计了一组用于结合S1酶保护分析的分子探针***,该探针具有很高的甄别灵敏度,能够将LY10与丛毛单胞属（Commonas）等5种细菌区分开;分子探针定量分析假单胞菌LY10,其细胞量与吸光值呈线性关系,检测的线性范围为103～106 cells/mL,线性方程为：y=-0.967 87＋0.372 99x（R2=0.996 7,n=5）。【结论】新筛的假单胞菌LY10的脱氮除磷能力较强,具有生物脱氮除磷的工业化应用潜质。所建立的结合S1酶保护分析的分子探针技术的特异性和灵敏度良好,有望应用于混菌体系中的假单胞菌的定性定量分析。

摘要：根据已报道的植酸酶基因序列设计一对引物,用PCR方法从嗜热真菌(Thermomyces sp.)中扩增获得不含信号肽和内含子的植酸酶基因(phyT),对该1.4kb的片段进行克隆与序列测定。序列分析表明该基因与已报道的嗜热疏绵霉(Thermomyces lanuginosus)的植酸酶基因相似性最高,DNA和氨基酸水平相似性分别达到95%和99%。将phyT基因插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒pPIC9K-phyT并电转化毕赤酵母(Pichia pastoris GS115)。植酸酶基因成功在毕赤酵母中表达并对重组酶酶学性质进行了研究。诱导表达酶活结果显示与野生型菌株相比,活性提高了67.8%,最适温度65℃,75℃处理20min后仍有70%以上酶活活性。最适pH为6.0。SDS-PAGE分析显示其分子量约55ku以上。

摘要：【目的】为了更好地分析霉菌在白酒发酵过程中的作用,需要快速准确地测定发酵过程中霉菌生物量的变化,本实验以白酒酿造中常用的塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)为例,建立一套快速准确定量塔宾曲霉生物量的方法。【方法】优化从酒醅中提取基因组的方法,设计和验证专一性引物,建立实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)方法,验证方法的有效性并应用于白酒发酵过程中塔宾曲霉生物量的检测。【结果】用原位机械破碎法提取酒醅中总基因组,其DNA的浓度能够达到1.060×105 ng/g酒醅;同时建立了一套快速准确测定固态基质中霉菌生物量的方法,并应用于白酒生产(制曲、堆积发酵和窖池发酵过程)中塔宾曲霉生物量的定量。【结论】实时荧光定量PCR方法能够快速准确地测定固态基质中霉菌的生物量,且检测限较低,对今后的相关研究具有借鉴意义。

摘要：利用Design Expert软件中水平设计和响应面分析法对产酶基本培养基主要成分进行了优化,经过逐步回归分析建立了丝氨酸羟甲基转移酶(SHMT)活力对培养基主要成分的二次回归模型,其回归方程的决定系数达到了0.9984。得到的最佳培养基主要组成为:葡萄糖29.5g/L、硫酸铵18.1g/L、玉米浆3.79g/L。SHMT活力最高达到113.7U/mL,比优化前(77U/mL)提高了47.7%。优化后的酶液经酶促反应50h,能催化产生10g/L的L-丝氨酸,比优化前(6g/L)提高66.7%。