摘要：食品功能因子作为功能性食品制造的基础素材,是食品中真正起生理作用的有效成分,在调节人体机能,改善睡眠和促进生长发育等方面发挥着重要作用.合成生物学作为一种更安全、更健康和绿色可持续的食品获取方式,已经成为推动食品行业发展的重要技术支撑.食品合成生物技术主要通过采用合成生物学技术设计构建食品组分的合成途径,创建具有食品工业应用能力的智能化细胞工厂,大幅提升食品功能因子等高附加值产品的合成效率.目前,以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、谷氨酸棒杆菌和酿酒酵母等模式微生物作为合成载体,通过对其生长进行精细调控,食品功能因子的生物制造已取得重大进展.本文主要从转运蛋白工程改造提高细胞生长速率、重编程细胞能量代谢和平衡细胞生长与产物合成方面总结了基于模式微生物生长特性调控合成食品功能因子的研究策略和进展,提出了目前所面临的挑战,并对其未来发展做出展望.

摘要：D-阿洛酮糖是一种重要的稀少糖,在食品、化妆品和医药等领域都有着广泛的应用价值。目前,工业上生产D-阿洛酮糖以生物酶法为主。由于传统酶法存在步骤烦琐、成本高、产物纯化分离难等缺点,已难以满足工业生产需要。近年来,全细胞合成体系以其低成本、便操作、易分离等特点受到人们的关注。以一种来源于Caballeronia insecticola的D-阿洛酮糖3-差向异构酶(DAEase)为研究对象,实现了在生产安全菌株枯草芽孢杆菌WB800中的高效异源表达,并以D-果糖为底物全细胞催化合成D-阿洛酮糖。为了提高DAEase的表达量,通过设计构建含有不同组成型启动子的重组菌株对其表达进行了优化。并对全细胞反应体系的条件(温度、pH值、金属离子、细胞浓度)进行了优化,探究了不同底物浓度下D-果糖的转化效率。结果表明:启动子PylbP介导下的重组DAEase在枯草芽孢杆菌WB800内具有较高的表达水平,重组DAEase全细胞反应的较适温度为65℃,较适pH值为9.5,较适金属离子为5 mmol/L Mg^(2+)。采用全细胞方法以500 g/L D-果糖为底物制备D-阿洛酮糖,4 h内反应基本达到平衡,转化率为30.06%。研究旨在为D-阿洛酮糖工业规模化生产提供实验基础和理论依据。

摘要：基于本课题组前期工作基础,在天然产物去氢骆驼蓬碱(harmine)的C7位氧上引入环己基甲基,并在N9位上通过不同长度的烷基链偶联甲基2-氨基-β-D-葡萄糖苷,设计并合成了8个去氢骆驼蓬碱糖基偶联物(14a~14h)。体外抗肿瘤活性筛选和构效关系研究发现,偶联物的抗肿瘤活性随连接臂中烷基链长度的延长而增加。化合物14h对MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖抑制活性显著优于去氢骆驼蓬碱。与去氢骆驼蓬碱相比,糖基的引入改善了化合物14h的水溶性,并通过Warburg效应提高了化合物14h的肿瘤细胞选择性。机制研究发现化合物14h可诱导MDA-MB-231细胞凋亡和G_(0)/G_(1)期细胞阻滞,并能通过干扰细胞上皮-间充质转化进程抑制肿瘤细胞迁移。本研究为基于去氢骆驼蓬碱的抗肿瘤药物的开发提供了新思路。

摘要：在体外设计和构建多种仿生纳米材料是人类理解天然自组装机制的基础。胶原蛋白是动物体内含量最高的蛋白质,也是生物医用材料领域最常用的天然高分子之一。化学合成的类胶原多肽来源清洁、可设计性高,是理想的纳米生物基底材料。目前类胶原多肽自组装的策略多基于二硫键、静电引力,π–π堆叠,金属配位等单一作用力,鲜有利用有机小分子提供弱作用力诱发肽分子之间自组装。本研究利用有机分子4,4’-亚甲基双(异氰酸苯酯)修饰类胶原多肽的氮端,通过圆二色谱、动态光散射和原子力子显微镜等方法对组装体形成进行表征。研究结果显示4,4’-亚甲基双(异氰酸苯酯)不仅能够显著提高类胶原多肽折叠形成三股螺旋的热稳定性,还可促进其组装形成形貌规整的纳米纤维。本研究为类胶原多肽的组装提供了一种简单高效的新策略。

摘要：提高酶的热稳定性是生物催化领域的热点和难点,计算机辅助的理性设计相比于传统的定向进化更加高效,在酶工程领域中的应用越来越广泛和深入。文中以枯草芽孢杆菌脂肪酶A为模式蛋白,首先,利用Rosetta-VIP计算设计对酶的结构空腔进行分析,选择了16个有利于结构空腔填充(ΔΔE<0)的单点突变,并以突变位点的溶剂可及表面积和进化保守性为二次筛选依据,测定了其热稳定性与酶活性。有6个单点突变体(F17A、V74I、L114P、I135V、M137A、I157L)的热稳定性得到了提高,其中Tm值最大提高3.18℃。结果表明,单点突变体满足ΔΔE越低、蛋白溶剂可及表面积减少且符合序列保守性,则得到保留原有酶活力的正向突变的可能性越大。此外,将热稳定性提高的6个单点突变进行迭代组合突变,两点组合突变体的Tm最大提高4.04℃,三点组合突变体的Tm最大提高5.13℃,四点组合突变体的Tm提高了7.30℃,六点组合突变体的Tm提高了7.43℃。因此,基于酶的分子结构的空腔分析、溶剂可及表面积及氨基酸序列保守性计算的多重虚拟筛选方法,可有效提高酶的热稳定性。

摘要：肝素和硫酸乙酰肝素是一类应用于临床抗凝血的糖胺聚糖。肝素葡萄糖醛酸C5异构酶(Heparosan-N-sulfate-glucuronate 5-epimerase,C5,EC 5.1.3.17)是肝素和硫酸乙酰肝素合成过程中重要的修饰酶,催化N-硫酸化肝素前体(N-sulfoheparosan)的D-葡萄糖醛酸(D-GlcA)上5号位羧基翻转生成L-艾杜糖醛酸(L-iduronic acid,L-IdoA)。文中以大肠杆菌Escherichia coli为宿主对斑马鱼来源的肝素葡萄糖醛酸C5异构酶基因Glce进行重组表达优化与分子改造。比较了3种不同的表达载体pET20b(+)、pET28a(+)和pColdⅢ对C5表达的差异情况,其中以嗜冷启动型载体pColdⅢ表达酶活最高,达到(1873.61±5.42)U/L。为了进一步提高C5的可溶表达量,在N端融合促溶标签SET2后,可溶蛋白表达量比对照提高了50%,酶活达到(2409.25±6.43)U/L。在此基础上,通过理性设计对底物结合口袋进行定点突变,获得最优突变体(V153R)的酶活和比酶活分别为(5804.32±5.63)U/L和(145.14±2.33)U/mg,是原始酶的2.41倍和2.28倍。肝素C5异构酶改造与表达优化为酶法催化合成肝素奠定了基础。

摘要：目的·研究α-1,3-甘露糖转移酶(α-1,3-mannosyltransferase,ALG3)基因异常导致的先天性糖基化疾病(ALG3-CDG)相关突变蛋白的活性检测方法,并检验其活性与疾病严重程度的关系。方法·收集文献报道的ALG3-CDG患者ALG3蛋白6个突变位点(I69T、W71R、G96R、M157K、R171Q和M209T),同源比对人和酿酒酵母ALG3蛋白的氨基酸序列,设计对应的酿酒酵母ALG3突变体(I70T、Y72R、G98R、L157K、R171Q和M221T),并在大肠埃希菌体系中表达。利用含有野生型ALG3或其突变蛋白的大肠埃希菌菌膜催化甘露糖基转移反应,采用液相色谱-质谱联用技术,以野生型蛋白催化活性为基准,计算突变蛋白的相对活性。比较不同生存期患者对应突变蛋白的活性。结果·ALG3-CDG患者6个突变对应的酿酒酵母ALG3突变蛋白均在大肠埃希菌体系表达,蛋白表达量与野生型基本一致。体外定量活性测试结果显示,与野生型蛋白相比,I70T、Y72R、G98R、L157K、R171Q、M221T突变蛋白的相对活性分别为2.8%、4.9%、4.5%、17.2%、4.8%、22.3%。生存期大于1年患者对应的突变蛋白活性显著高于小于1年的患者(P=0.002)。结论·建立了ALG3-CDG相关酿酒酵母保守突变蛋白的体外定量活性检测方法,为该病严重程度的预测提供了可能。

摘要：糖氨基酸(sugar amino acids,SAAs)是一类同时含有氨基和羧基的糖类衍生物,具有糖和氨基酸的结构特征和化学反应特性,常作为多功能合成砌块用于组合化学的研究、糖模拟物和多肽模拟物的构建等.因此,该类化合物的设计与合成受到国内外化学家的持续关注.在本文中,我们发展了一种简单、高效的合成新型糖氨基酸的方法,从廉价易得的3,4,6-O-三乙酰基-D-葡萄糖烯和3,4,6-O-三乙酰基-D-半乳糖烯出发,在硝酸铈铵(CAN)的作用下通过一步自由基加成反应分别得到2-C-二羧酸酯类化合物gluco-2和galacto-2,再经过脱羧、脱乙酰、碘代、叠氮化钠取代和一锅法还原氨化反应,以最短直线步骤6步实现了糖氨基酸gluco-7(总收率34%)和galacto-7(总收率19%)的合成.所有合成的化合物均经过IR,1H NMR,13C NMR和HRMS的表征.

摘要：采用合成生物学与代谢工程技术设计与构建微生物细胞工厂是实现化学品绿色生物制造的重要方法。微生物发酵过程中低产细胞亚群和非生产细胞亚群由于代谢负担轻,更加具有生长优势,会降低产物合成的综合效率。目前,基于响应产物浓度的生物传感器,偶联产物合成与生长的细胞亚群调控系统有助于解决这个问题。综述了细胞亚群调控系统设计和构建的常用方法,重点讨论了目前细胞亚群调控系统存在的问题及其解决策略。

摘要：顺式-3-羟基-L-脯氨酸(顺式-3-羟脯氨酸)可用于合成多种抗癌药物,具有重要的商业价值,目前大多通过添加IPTG来诱导表达脯氨酸-3-羟化酶,采用两步法生物合成顺式-3-羟脯氨酸。作者通过目的基因优化设计,引入强启动子色氨酸串联启动子(Ptrp2)来避免异源表达时的诱导剂使用,构建重组质粒p ES-Ptrp2-P3H,成功构建了重组大肠杆菌BL21(DE3)/p ET21a-Ptrp2-P3H,优化后的脯氨酸-3-羟化酶基因(P3H)改变了168个碱基,GC含量由原来的64.83%降低到49.31%。该菌在初步优化培养基(葡萄糖1 g/d L,甘油0.125 g/d L,胰蛋白胨1.6 g/d L,(NH_4)_2SO_40.5 g/d L,K_2HPO_40.1 g/d L,NaCl 0.2 g/d L,FeSO_41 mmol/L,MgSO_40.5 g/d L,CaCl_20.015 g/d L,脯氨酸10 g/L,pH 7.5)上能一步法原位合成顺式-3-羟脯氨酸,摇瓶发酵24 h,产量0.8 g/L,比优化前提高一倍以上,为进一步开展顺-3-羟脯氨酸产业化提供了依据。