摘要：目的:构建靶向Th1细胞特异性转录因子T-bet的小发卡结构RNA(shRNA)的真核表达载体,并评价其功能,为开展T-bet相关性疾病的免疫干预研究奠定基础。方法:设计并合成靶向T-bet的shRNA序列,构建真核表达载体,并转染DC2.4细胞;MTT法检测转染后DC2.4细胞增殖能力,用RealtimePCR和Westernblot分别从基因及蛋白水平检测转染前后DC2.4细胞T-bet表达水平变化;RealtimePCR检测IFN-γ的mRNA;流式细胞术(FCM)检测细胞表面CD80、CD86与MHCⅡ类分子表达情况。结果:构建的T-bet靶向shRNA真核表达载体,能够显著抑制DC2.4细胞T-bet的表达,且转染后DC2.4细胞增殖受到抑制,CD80、CD86及MHCⅡ类分子表达下调,IFN-γmRNA水平显著下降。结论:成功地构建了T-betshRNA真核表达载体,转染DC2.4细胞后能有效地抑制其T-bet、IFN-γ的表达,影响其抗原提呈功能。

摘要：目的:建立稳定、高表达鼠转录因子Hlx的树突状细胞系DC2.4/mHlx。方法:参照GenBank中mHlx基因序列,设计mHlxCDS全长引物;以PGEM-T/mHlx质粒为模板,通过PCR获得目的基因,再克隆到PIRES2-EGFP真核表达载体,经PCR、酶切鉴定后进行序列测定,用脂质体转染DC2.4;应用G418筛选出耐药克隆,有限稀释法进行单克隆。通过观察EGFP的表达选定单克隆细胞株,再用流式细胞术分析、Real-time PCR和Western blot进行鉴定。结果:构建了PIRES2-mHlx-EGFP真核表达载体,并成功建立mHlx修饰和EGFP修饰的细胞系(DC2.4/mHlx和DC2.4/EGFP)。结论:成功建立稳定高表达mHlx的树突状细胞系DC2.4/mHlx,为深入探讨mHlx功能构建了平台,为Hlx修饰后的树突状细胞作为工具细胞的应用奠定了基础。

摘要：目的:克隆牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB基因、原核表达并制备牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB多克隆抗体。方法:根据牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB的DNA序列,设计特异性引物并经PCR扩增其基因。扩增产物经鉴定和测序分析后,与质粒pET-32a(+)重组形成pET-32a-ragB,继而转化大肠埃希菌。IPTG诱导重组蛋白的表达,再通过Ni-NTA亲和层析柱纯化后,用SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定;获得的重组蛋白行常规家兔免疫,以制备多克隆抗体,并应用ELISA测定抗体效价。结果:PCR扩增获得编码区全长为1506bp可编码501个氨基酸的RagB基因,测序结果与GenBank公布的序列(AJ130872)完全一致;构建了pET-32a-ragB原核表达载体,获得了高表达的融合蛋白,SDS-PAGE电泳和Western blot表明具有较高的纯度;ELISA结果显示,特异性兔抗RagB的多克隆抗体效价为1×105。结论:在成功构建牙龈卟啉菌外膜蛋白RagB原核表达载体的基础上,高效表达及纯化了RagB融合蛋白,并制备了高效价的多克隆抗体。为进一步开展牙龈卟啉菌疫苗研究、建立牙龈卟啉菌感染的实验室诊断方法奠定了基础。