摘要：目的:建立稳定、高表达鼠转录因子Hlx的树突状细胞系DC2.4/mHlx。方法:参照GenBank中mHlx基因序列,设计mHlxCDS全长引物;以PGEM-T/mHlx质粒为模板,通过PCR获得目的基因,再克隆到PIRES2-EGFP真核表达载体,经PCR、酶切鉴定后进行序列测定,用脂质体转染DC2.4;应用G418筛选出耐药克隆,有限稀释法进行单克隆。通过观察EGFP的表达选定单克隆细胞株,再用流式细胞术分析、Real-time PCR和Western blot进行鉴定。结果:构建了PIRES2-mHlx-EGFP真核表达载体,并成功建立mHlx修饰和EGFP修饰的细胞系(DC2.4/mHlx和DC2.4/EGFP)。结论:成功建立稳定高表达mHlx的树突状细胞系DC2.4/mHlx,为深入探讨mHlx功能构建了平台,为Hlx修饰后的树突状细胞作为工具细胞的应用奠定了基础。

摘要：目的 :运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立IL-15基因敲除的MGC-803胃癌细胞株。方法 :针对IL-15基因作用的功能域,设计了靶向IL-15基因Exon2的gRNA。构建PX458-gRNA重组质粒并转化感受态细胞Stbl3,筛选出重组子后进行测序,通过测序确认了所设计的gRNA的有效性。并进一步通过流式细胞分选以及ELISA法检测筛选出的MGC-803胃癌细胞株IL-15基因的表达水平。结果 :测序结果显示敲除质粒构建成功,与阴性对照组相比,转染PX458-IL-15-g RNA质粒组IL-15的表达水平明显低于阴性对照组,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论:利用CRISPR-Cas9系统成功构建了IL-15基因敲除的MGC-803细胞,为后续研究IL-15在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础。

摘要：目的鉴定小儿复方鸡内金散中鸡内金的真伪。方法根据家鸡、麻鸭、家鹅的线粒体基因序列设计和筛选引物,优化反应条件和体系,建立基于特异性引物的多重PCR法进行鉴别。结果鸡内金、鸭内金、鹅内金DNA在优化条件下,分别在94、124、155 bp处产生了清晰、明亮的条带,并且未观察到非特异性扩增,呈现出较好的特异性,检测灵敏度均达到0.1 ng/μL。来源于8个厂家的11批样品中,有2批检出了鸭内金掺伪,检出率为18.2%。结论该方法灵敏度高,特异性强,可为更好地监控含鸡内金中药制剂的质量提供新颖的途径和有力的手段。

摘要：目的建立细菌16SrDNA基因半巢式PCR检测方法,并与血培养方法比较,评估其在临床败血症的诊断价值。方法针对16SrDNA高度保守区设计半巢式PCR引物,并对92例临床疑为败血症的患者血标本同时进行血培养和16SrDNA基因检测。结果 92例疑为败血症患者16SrDNA基因检测阳性45例,阳性率为48.9%;血培养检测阳性标本24例,阳性率为26.1%。经χ2检验,PCR检测的灵敏性明显高于血培养(P<0.05)。结论半巢式PCR方法检测细菌16SrDNA基因具有高敏感、高特异及快速的优点,是一种易于推广的早期败血病诊断方法。

摘要：目的制备肠道病毒71型(EV-A71)3A蛋白的肽段抗体。方法利用ExPasy和DNAstar软件对EV-A71 3A蛋白的跨膜结构域、二级结构、亲水性及疏水性等生物学特性进行分析,设计并合成2条14个氨基酸的多肽。用钥孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)偶联肽段作为抗原分别免疫Balb/c小鼠,免疫结束后取小鼠全血分离血清,用免疫印迹实验(Western blot)对血清中的3A蛋白抗体进行鉴定。结果Western blot结果显示,第一条3A蛋白的多肽不能刺激小鼠产生特异性抗体,而第二条多肽能够刺激小鼠产生特异性抗体。结论成功制备特异性较好的3A肽段抗体,为进一步研究3A蛋白提供了工具。

摘要：目的:研究血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)对大肠癌肝转移的影响。方法:根据VEGF基因mRNA设计合成小干扰RNA,采用荧光实时定量PCR检测VEGF mRNA水平,分别以软琼脂集落培养试验和Boyden模型观察癌细胞锚着不依赖性增殖和癌细胞侵袭能力。以脾切除法建立大肠癌肝转移模型,以不同方法处理的癌细胞接种模型,观察对大肠癌细胞肝转移的影响。结果:转染组VEGF基因mRNA水平明显降低,且呈浓度和时间依赖性。经VEGF siRNA转染处理的癌细胞软琼脂集落形成数和穿膜细胞数明显减少,且呈浓度依赖性(P<0.05,P<0.05)。体内试验发现,对照组10只全部出现大肠癌肝转移灶,而siRNA组仅仅1只出现肝转移,差异具有显著统计学意义(P<0.01)。结论:VEGF基因在大肠癌肝转移中起着重要的作用;以RNAi技术沉默VEGF基因表达,可抑制大肠癌细胞肝转移。

摘要：目的探讨急危重症患者动脉全血和静脉血浆中电解质、血糖(Glu)及乳酸(Lac)浓度的差异性。方法收集30例急危重症患者标本和资料,采用自身配对设计,比较动脉全血和静脉血浆中电解质、Glu及Lac浓度;使用国家卫生行业标准(WS/T 403-2012)和国家卫生健康委员会临床检验中心的允许总误差判断标本之间偏差是否具有临床意义;通过相关性分析比较标本之间是否存在关联,并计算相关系数;建立一元线性回归方程模型,并计算模型的决定系数。结果与动脉全血相比,静脉血浆中钾离子(K^(+))、钠离子(Na^(+))、钙离子(Ca 2^(+))、Lac水平偏高(P<0.05),氯离子(Cl^(-))、Glu水平偏低(P<0.05)。进一步分析发现动脉全血和静脉血浆中K^(+)、Na^(+)、Cl^(-)、Glu水平比较差异无临床意义,而Ca、Lac水平比较差异有临床意义。此外,动脉全血和静脉血浆中K^(+)、Na^(+)、Cl^(-)、Glu、Lac水平均呈正相关(r=0.92、0.94、0.97、0.94、0.82,P<0.05),相关性强且具有较好的拟合度。结论动脉全血和静脉血浆之间电解质、Glu及Lac浓度存在差异性,可通过线性方程由动脉全血中K^(+)、Na^(+)、Cl^(-)、Glu、Lac结果计算出静脉血浆中相应指标浓度。

摘要：目的:建立检测人RORγt(retinoid-related orphan receptor gammat)mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)方法。方法:根据人RORγt mRNA的保守序列设计特异性引物,提取经PMA和离子霉素刺激的人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)总RNA,并逆转录成cDNA,与pMD-18T载体连接构建质粒标准品。采用qRT-PCR方法检测RORγt mRNA水平,并评价该方法的线性、特异性及重复性。应用该方法检测Graves病(Graves′disease,GD)患者外周血中RORγt mRNA的相对表达。结果:该方法标准曲线的相关系数为0.998,融解曲线分析显示单个峰,pMD18T-RORγt质粒标准品高、低拷贝数的批内、批间变异系数分别为6.5%,8.4%和9.6%,11.2%。初步研究表明GD患者组RORγt mRNA的相对表达水平明显高于健康对照组(t=-3.72,P<0.01)。结论:建立的检测人RORγt mRNA的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法灵敏、特异且重复性好,为临床应用提供了实验基础。

摘要：目的:构建肿瘤标志物细胞角蛋白19(CK19)基因的原核表达载体,并在大肠埃希菌中进行表达,以获取低成本、高产量、高纯度的CK19蛋白。方法:根据基因库CK19的基因序列,设计多条用于基因拼接的DNA引物,利用PCR技术扩增CK19基因,用基因重组技术将该片段克隆到质粒p ET28a中,PCR和DNA测序鉴定。将重组质粒CK19-p ET28a转化大肠埃希菌BL21中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,使用镍柱亲和层析纯化蛋白,并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹鉴定。结果:成功扩增出CK19基因片段,克隆到表达载体后经菌落PCR和DNA测序鉴定正确。重组质粒CK19-p ET28a在大肠埃希菌中经诱导和纯化后获得纯度较高目的条带,蛋白质印迹结果证明目的蛋白有反应性。结论:成功构建了肿瘤标志物CK19原核表达载体,经过诱导表达和蛋白纯化获得了高纯度有活性的目的蛋白。

摘要：目的构建人外周血单个核细胞中骨形态发生蛋白(BMPs)(BMP2,BMP4,BMP6,BMP7,BMP9)mRNA的定量PCR检测方法;利用荧光定量PCR检测研究BMPs mRNA在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中的表达情况。方法利用primer3在线软件设计BMP2,BMP4,BMP6,BMP7,BMP9的定量PCR检测引物并比对其扩增产物信息;收集类风湿性关节炎患者60例(RA组)和健康对照组30例(NC组)的外周血,利用人单个核细胞分离液分离单个核细胞并提取总RNA,然后逆转录成cDNA;最后利用定量PCR检测各标本中BMPs表达水平,采用2-△△Ct法计算各指标相对表达水平。结果(1)成功设计出BMP2,BMP4,BMP6,BMP7,BMP9的定量PCR引物,其扩增产物长度为168 bp^203 bp,扩增曲线提示目的基因与内参基因β-actin扩增效率一致(扩增曲线斜率差<0.1)。(2)RA组与NC组相比BMP2表达相对上调1.21(0.8)倍(t=0.22,P=0.005)、BMP6表达相对下调0.95(0.26)倍(t=0.176,P=0.043),差异有统计学意义。RA组与NC组相比BMP4表达下调0.41(0.33)倍(t=0.098,P=0.583)、BMP7表达相对下调0.49(0.58)倍(t=0.125,P=0.285)、BMP9表达相对下调0.39±0.21倍(t=0.084,P=0.76),差异均无统计学意义。(3)RA组按照DAS28评分分为RA1组(n=12,DAS28评分<2.6,病情缓解),RA2组(n=14,DAS28评分≥2.6且<3.2,低度活动),RA3组(n=16,DAS28评分≥3.2且<5.1,中度活动),RA4组(n=18,DAS28评分≥5.1,高度活动)。BMP2表达水平随着DAS28评分增高表达逐渐升高,BMP4,BMP6,BMP7,BMP9表达水平随着DAS28评分增高逐渐降低,RA各组BMPs表达差异有统计学意义(P=0.000)。(4)BMP2与DAS28评分呈显著正相关(r=0.886,P=0.000);BMP6与DAS28评分呈显著负相关(r=-0.825,P=0.000),差异均有统计学意义。结论RA组外周血单个核细胞中BMP2 mRNA表达明显上调,BMP6 mRNA表达明显下调,BMP4 mRNA、BMP7 mRNA、BMP9 mRNA表达差异无统计学意义,BMP2与DAS28评分呈显著正相关,但BMP6与DAS28评分呈显著负相关,提示BMPs作为RA患者的分子标志物具有潜在的应用价值。