摘要：目的猪鼻支原体(Mhr)是临床猪场常见病原菌之一,同时研究证实其与多种人类肿瘤有关。目前对Mhr的血清学检测尚无有效的方法。本研究以Mhr可变脂蛋白(vlp)家族为对象,设计vlp家族蛋白重复区片段融合蛋白,以作为检测用包被抗原使用。方法根据大肠杆菌的密码子偏嗜性,设计并构建串联表达7种Mhr可变脂蛋白vlpA、B、C、D、E、F、G重复区片段的重组蛋白vlpA-G基因。将该基因片段装入pET-32a(+)载体中转化大肠杆菌,筛选鉴定获得阳性工程菌。IPTG诱导表达,镍柱亲和层析获得纯化的重组蛋白vlpA-G。Western Blot鉴定该重组蛋白与Mhr阳性血清的反应能力,并利用该重组蛋白为包被抗原初步建立间接ELISA方法用于检测猪血清中的Mhr抗体。结果构建表达vlpA-G重组蛋白的基因工程菌,经PCR及DNA测序正确。IPTG诱导后出现明显蛋白条带,经镍柱亲和层析纯化获得vlpA-G重组蛋白。Western Blot试验证明重组蛋白vlpA-G能够和Mhr阳性兔血清产生明显的阳性杂交带;利用重组vlpA-G为包被抗原初步建立间接ELISA检测方法可成功检测Mhr阳性猪血清,证明该重组vlpA-G蛋白具有良好的反应原性。结论本研究构建了重组蛋白vlpA-G并证实该蛋白具有良好的反应原性,可作为Mhr血清学诊断方法研究的候选抗原,同时也为Mhr重组蛋白疫苗提供可选抗原。

摘要：目的旨在建立同时检测stx2和intimin两个基因多个变型的双重PCR快速检测技术，更好满足实验室和临床检测的需求。方法以stx2主要的6个亚型和intimin主要的27个基因亚型为靶序列，设计引物，建立双重PCR方法，分析其敏感性、特异性，并检测模拟制备的阳性样品。结果stx2-intimin双重PCR扩增片段分别为388bp和609bp，检测大肠杆菌纯培养物最低限介于10～100cFu／mL，增菌样品最低检测限介于1～10CFU／g，特异性检测intimin和stx2的多个亚型。结论Stx2-Intimin二重PCR技术灵敏、特异、通用和高效。

摘要：通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5对其纯化,并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-NS5,经双酶切鉴定及测序正确后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白最终经SDS-PAGE及Western-blotting鉴定。结果显示,NS5融合蛋白分子质量约为120 ku,在诱导后5 h达到表达量高峰,融合蛋白以包涵体形式存在,Western-blotting显示原核表达的蛋白可被兔抗鹅坦布苏病毒血清特异性识别,表明以NS5蛋白为抗原制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性。

摘要：根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR方法扩增得到完整的NS1基因,并将其克隆至原核表达载体pET28a和pET32a上,构建出重组表达质粒pET28a-NS1和pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中,经IPTG诱导得到NS1融合蛋白(His-NS1),其分子质量约分别为44,58 kDa,均在诱导后6 h达到表达量高峰。分析显示,2种融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性后均可获得单一、高表达量的目的蛋白,为进一步开展关于鹅坦布苏病毒NS1蛋白的研究奠定了基础。

摘要：利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验。结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果。在灵敏度试验中,rfbE-LAMP对O157菌液和模拟阳性样品的最低检测限分别为1CFU/mL和1CFU/g。在特异性试验中,以其他血清型大肠杆菌以及沙门杆菌基因组DNA为模板对rfbE基因进行检测,均没有发生非特异性扩增反应。试验建立的LAMP检测方法具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求。

摘要：应用巢式聚合酶链式反应(Nested PCR)建立了一种检测猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis)的方法,试验中以酚-氯仿法制备模板DNA,根据猪鼻支原体P37序列高度保守区设计2对引物,建立Nested PCR诊断方法。在特异性检测试验中,设计的引物不能扩增出猪絮状支原体、猪滑液支原体、猪肺炎支原体、鸡毒支原体、胸膜肺炎放线杆菌、猪瘟病毒、猪流感病毒、猪圆环病毒及猪繁殖与呼吸综合征病毒等病原体;敏感性试验表明,第1次PCR和第2次PCR的敏感度分别为3.01mg/L和3.01×10-4 mg/L。对41份临床样品肺组织的检测中,普通PCR和巢式PCR的检出率分别为29.3%(12/41)和82.9%(34/41)。结果表明,巢式PCR方法明显优于常规PCR方法,具有较高的敏感性和实用性,为猪鼻支原体的检测提供了一种新型、可靠的诊断技术。

摘要：为建立快速检测猪鼻支原体(***)的荧光定量PCR方法,本研究根据GenBank中登录的p37基因序列设计并合成引物及MGB探针,构建含有p37基因的重组质粒,以其为标准品绘制标准曲线,并检测该方法的特异性、敏感性和重复性。结果显示该方法具有良好的特异性,与猪肺炎支原体、猪絮状支原体、猪滑液支原体、鸡毒支原体、副猪嗜血杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌、猪圆环病毒、猪瘟病毒及猪流感病毒无交叉反应,对***的检测敏感性为10拷贝/μL,并且稳定性好,变异系数小于2%。利用建立的荧光定量PCR方法对55份临床样品进行检测,阳性检出率为87.3%(48/55),而分离培养方法和普通PCR的阳性检出率分别为41.8%(23/55)和29.1%(16/55)。该结果表明,建立的方法特异性强、敏感性高、稳定性好,可以用于***临床样品的检测,对***的快速和定量检测具有重要意义。

摘要：选取鹅黄病毒囊膜蛋白(E蛋白)基因进行克隆、表达和纯化,以获得能应用于血清学诊断和可作为亚单位疫苗的重组蛋白。根据鹅黄病毒JS804株全基因序列设计了1对引物,采用RT-PCR方法扩增出了鹅黄病毒的E基因,将其克隆到表达载体pET32a(+)中,构建了重组表达质粒pET32a-E,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达。结果表明,鹅黄病毒E基因在大肠杆菌中获得高效表达,融合蛋白分子量约为70 kDa,主要以包涵体形式存在于菌体中。Western Blot和间接免疫荧光试验发现,重组E蛋白具有较好的反应原性和良好的免疫原性。鹅黄病毒E蛋白的原核表达为进一步研究该蛋白功能、建立血清学检测方法及研制亚单位疫苗奠定了基础。

摘要：为了建立定量检测猪链球菌2型(SS2)粘附相关因子mRNA转录水平的荧光定量PCR方法,根据已报导的SS2粘附相关因子甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、分选酶A(SrtA)、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGD)及其管家基因aroA,用GenBank登录的核苷酸序列,设计特异性引物,提取SS2总RNA,经RT-PCR扩增和克隆了各粘附相关因子的核苷酸片段,以构建含有各自引物扩增序列的重组质粒,建立检测各粘附相关因子SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法起始模板数的对数与荧光信号达到所设定荧光阈值所经历的循环数(Ct)之间线性关系好,相关系数均达到0.995以上;扩增产物形成单一的特异性熔解峰;初始模板的检出下限达到了1μl 1.0×102拷贝数;组内变异系数小于2%,说明该方法特异性强、敏感性高、重复性好。

摘要：为建立鲜奶中肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic ***,EHEC)O157∶H7的特异性检测方法,以EHEC O157∶H7独有的遗传标志性基因Z0372为靶序列设计引物和探针,以梯度稀释的含有Z0372基因的重组质粒作为标准品进行Taqman荧光定量PCR反应,分析该方法的敏感性、特异性,并检测鲜奶样品以验证Taqman荧光定量PCR实用性和可靠性。结果表明,建立的定量PCR方法在1μl 1×101拷贝至1μl 1×106拷贝之间具有良好的线性关系,相关系数达到0.996,扩增效率112%。该方法的检测灵敏度为1μl 70拷贝,敏感性较高,而且特异性良好,与其他血清型大肠杆菌、沙门氏杆菌和志贺氏菌等易混淆菌株核酸之间没有交叉反应。批间和批内检测的变异系数(RSD)低于2%,表明该方法重复性良好。