摘要：[目的]本研究通过优化试验条件,建立基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速、准确地将外源基因定向插入鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus, DEV)基因组的方法,为以DEV为载体的重组疫苗的研制奠定基础。[方法]分离并扩繁DEV疫苗株,测定其病毒滴度。根据DEV疫苗株UL26、UL27基因间非编码区序列,设计合成向导RNA(gRNA),经双链退火获得目的片段,通过基因克隆技术将其插入PX459-V2.0载体获得gRNA-Cas9质粒。同时,通过常规基因克隆技术将增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因插入PVAX-1载体,构建含有真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA的重组表达质粒。以DEV疫苗株基因组为模板,扩增gRNA上、下游同源臂序列,通过融合PCR将同源臂序列与真核表达盒P_(CMV)-EGFP-BGH pA进行连接并克隆至PUC19载体获得供体质粒PUC19-UP-EGFP-DOWN。采用先转染质粒后感染亲本DEV的策略构建重组病毒rDEV-EGFP,通过控制单一变量法优化重组病毒构建的试验条件,根据不同条件下绿色荧光蚀斑数量确定最佳条件。利用有限稀释法筛选并纯化表达绿色荧光的蚀斑,获得重组病毒rDEV-EGFP,并对其进行遗传稳定性及体外复制能力的评估。[结果]PCR扩增及测序结果显示,成功构建靶向DEV基因组UL27与UL26基因间非编码区序列的gRNA-Cas9质粒及包含EGFP真核表达盒的供体质粒。鸡胚成纤维细胞(chick embryo fibroblast, CEF)中转染gRNA-Cas9及供体质粒后感染DEV,在荧光显微镜下可观察到绿色荧光蚀斑,表明成功利用HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术将EGFP报告基因敲入DEV基因组。优化后的最佳试验条件为:DEV感染复数(MOI)为0.2、gRNA-Cas9质粒与供体DNA转染比例为1∶2、供体DNA的转染形式为DNA片段、转染与感染时间间隔为6 h、重组病毒收取时间为DEV感染后48 h,优化后EGFP报告基因的敲入效率显著提高(P<0.05)。重组病毒rDEV-EGFP在CEF中连续传代15次,EGFP真核表达盒仍稳定整合在UL26与UL27基因之间的非编码区,具有良好的遗传稳定性。生长曲线结果显示,重组病毒rDEV-EGFP在CEF中的复制能力与DEV疫苗株无明显差异,生长趋势一致,具有良好的体外复制能力。[结论]本研究建立了一种基于HDR-CRISPR/Cas9基因编辑技术快速构建重组DEV的方法,成功构建了具有良好遗传稳定性及体外复制能力的重组病毒rDEV-EGFP,为重组DEV载体疫苗候选株的研制提供了理论依据及技术平台。

摘要：智能物联网系统应用已成为现代温室大棚发展的方向。物联网协议众多、复杂,分布于诸层中。物联网感知设备与控制器间以无线协议为主,一类适用于近距离、低速率、低功耗、低成本、低复杂度无线通信,一类适用于远距离、低比特率、低功耗无线通信。网关与园区网络间以无线或有线连接,移动智能终端与云端服务器间以移动互联网接入。在基于多协议的温室智能物联网系统应用实例中,针对猕猴桃对生长环境的需求,设计了物联网系统架构,综合考虑温室诸多因素,合理选择ZigBee、IEEE 802.11x、TCP/IP以及4G/5G多种协议,并且为配合多协议应用选择了适宜的物联网设备。结果表明:传感网由无线信号收发模块连接至控制器,再经网关接入该地园区网络,然后传输数据给云端服务器存储,在互联网和移动互联网等网络通信基础上,实现感知、传输、处理功能。多协议智能物联网系统工作良好,性能稳定,达到了预期效果。

摘要：智能物联网系统仿真有益于物联网系统设计与实施。仿真试验采用高阶Packet Tracer虚拟化仿真软件,设计了具有智能感知、智能传输和智能控制功能的系统仿真模型,以及带有智能判断的系统控制模型,引入了动态环境管理,通过Python逻辑编程实现了智能物联网在感知层、传输层和应用层过程仿真。仿真结果表明,物联网系统每隔1 s获取到环境因子与执行器件状态,与对照用终端设备的检测结果一致;依据控制模型,远程终端和云端服务器能够智能或人工控制执行器件状态,实时调节环境因子。执行器件对环境因子的影响存在多对多的关系。仿真试验达到了研究目的。

摘要：为筛选能抑制DHAV-1复制的siRNA,探索RNAi技术在鸭病毒性肝炎防治中的应用,采用PCR法扩增DHAV-1 RdRp基因,并构建pEGFP-RdRp融合表达EGFP-RdRp蛋白;根据RdRp的序列测定结果,设计3条RdRp特异siRNA,并合成相应shRNA分别插入pmiRZipΔ中构建pRdRp-shRNA;共转染pRdRp-shRNA和pEGFP-RdRp于HEK-293T细胞,通过荧光显微镜法、流式细胞术、相对荧光定量PCR法筛选抑制效率较高的siRNA;将高效siRNA用于病毒载体pmiRZip介导的慢病毒制备;通过计算重组慢病毒转导、DHAV-1感染的鸭胚胎成纤维细胞中病毒TCID50和RdRp基因表达量确定siRNA对病毒及病毒基因的抑制作用。结果显示,3个siRNA均能抑制RdRp基因的表达,包含GDD模体的shRNA2的抑制率最高,对应重组病毒能使DHAV-1的TCID50下降6.2lg,RdRp基因转录量下降89.6%,抑制时间至少达120h,为鸭病毒性肝炎临床防治提供了新思路。

摘要：数控机床是现代机械产品加工生产环节中的重要平台,在原来加工平台的基础上,新型数控机床可被更精准地掌控,以应对更多样化的产品设计加工需要。大多数机械产品加工单位还在使用进口型的数控机床,不仅成本高,且加工算法也不能随意调整,加工监控工作也因此而受到影响,本文针对机床系统中的刀具刃磨需求,分析在840Dsl数控机床中设计二次系统的技术要点。

摘要：根据已发表的禽腺联病毒(AAAV)基因组序列设计了1对引物,经PCR扩增出VP3基因,将其克隆入原核表达载体pET-30a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下VP3蛋白获得了正确表达,SDS-PAGE结果显示,表达的重组蛋白的分子质量正确。将目的蛋白切胶免疫ICR小鼠,制备了针对重组蛋白VP3的多抗血清,Western-blot结果显示,制备的抗血清能够与AAAV VP抗原发生特异反应。结果表明,VP3基因在大肠杆菌中获得了成功表达,且制备的多抗血清可以用于VP基因的表达检测。

摘要：根据禽腺联病毒Rep基因序列设计2对引物,分别扩增出Rep78和Rep52基因,将其克隆至杆状病毒双表达载体pFastBacDual,获得重组穿梭质粒pFastBacDual-Rep,将其转化到*** DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组病毒表达质粒rBacmid-Rep。在脂质体的介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒rBac-Rep。SDS-PAGE结果分析表明,Rep78、Rep52均获得了表达,Western blot结果显示表达的重组蛋白能够与Rep52多抗反应,具有良好的反应原性。结论:禽腺联病毒的非结构蛋白Rep78、Rep52基因在昆虫细胞中获得了成功表达。

摘要：为在昆虫细胞中表达Ⅰ型鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus type-I,DHAV-I)SH株的主要结构蛋白VP3,首先根据DHAV-I SH株VP3基因序列设计1对引物,RT-PCR方法扩增出VP3基因,克隆至杆状病毒表达载体p Fast Bac1,获得重组杆状病毒转移载体p FB-VP3,将其转化到DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-VP3,在脂质体介导下转染昆虫细胞Sf9,获得重组杆状病毒r Bac-VP3。间接免疫荧光结果显示重组蛋白获得了正确表达,能与鸭抗全病毒阳性血清发生特异性反应。Western blot结果显示表达的重组蛋白分子量约为27 000。表明,DHAV-I SH株的主要结构蛋白VP3在昆虫细胞中获得了成功表达,为VP3结构蛋白的功能研究及相关亚单位疫苗的研制奠定了基础。

摘要：为获得单增李斯特菌溶血素(Listeriolysiono,LLO)蛋白及其多克隆抗体。根据单增李斯特菌溶血素蛋白的基因Hly序列设计了一对特异性引物,扩增出Hly基因,克隆入原核表达载体p ET-32a,并转化于大肠杆菌BL21中,在诱导剂IPTG的作用下重组LLO蛋白成功表达。SDS-PAGE结果表明重组蛋白分子量约为69.3 ku,且主要以包涵体形式表达LLO蛋白。将重组蛋白纯化后免疫新西兰大白兔,获得兔抗LLO抗体。Western-blot检测到一条约69.3 ku的特异性条带,表明该抗体具有较强的特异性。单增李斯特菌溶血素基因Hly在大肠杆菌中已成功表达,且制备的多克隆抗体可用于LLO蛋白的检测。

摘要：试验旨在利用杆状病毒表达系统制备输卵管特异表达人溶菌酶(h LYZ)的重组禽腺联病毒(recombinant avian adeno-associated virus,r AAAV)。参照已发表的h LYZ基因序列设计1对引物,PCR扩增h LYZ基因片段,亚克隆至含输卵管特异表达盒和禽腺联病毒(AAAV)两侧末端反向重复序列(inverted terminal repeat,ITR)的转移载体中,获得重组杆状病毒转移载体p FB-AIOVLYZ,将其转化到大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组穿梭质粒r Bacmid-AIOVLYZ,在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒r Bac-AIOVLYZ。将其与表达AAAV结构蛋白的重组杆状病毒r Bac-VP及表达AAAV功能蛋白的重组杆状病毒r Bac-Rep以感染复数(multiplicity of infection,MOI)为5感染Sf9昆虫细胞,72 h后收集细胞沉淀,并经滤膜过滤、氯仿抽提和PEG沉淀,即为r AAAV-OVLYZ。电镜结果显示,病毒粒子大小约为20 nm,形态结构与野生AAAV相似;PCR结果显示r AAAV含有目的基因;体外细胞表达试验说明r AAAV能介导h LYZ在输卵管细胞中的特异表达。结果表明,本研究利用杆状表达系统成功制备了输卵管特异表达h LYZ基因的r AAAV,为h LYZ的大量制备奠定了基础。