摘要：目的探讨白念珠菌菌丝对小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)自噬流的影响。方法白念珠菌菌丝分别体外诱导BMDM细胞0.5、4、12 h,以不加菌丝处理的0 h组作为对照,Western印迹法检测各时间点自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换及磷酸化雷帕霉素机制性靶蛋白(p-mTOR)的表达。白念珠菌菌丝分别联合4种溶酶体阻断剂,包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64d+胃蛋白酶抑制剂pepstatin、巴弗洛霉素-A1(BAF-A1)、氯化铵及氯喹,体外诱导小鼠BMDM细胞4、12 h,观察白念珠菌菌丝对BMDM细胞基础自噬流的影响。统计分析采用非配对t检验、析因设计的方差分析及LSD-t检验。结果白念珠菌菌丝体外处理小鼠BMDM 0.5、4和12 h后,与0 h组(0.983±0.030)相比,LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转换均增加(1.254±0.118、1.629±0.391、1.598±0.379),差异有统计学意义(t值分别为3.875、2.856、2.804,均P<0.05),但各组p-mTOR的蛋白表达无明显差异。白念珠菌菌丝联合E-64d+pepstatin体外处理BMDM细胞4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平较E-64d+pepstatin单独处理组明显增高,差异均有统计学意义(t值分别3.691、6.648,均P<0.05)。与相应溶酶体阻断剂组相比,白念珠菌菌丝联合BAF-A1、氯化铵或氯喹4和12 h后,LC3-Ⅱ的蓄积水平均显著升高(均P<0.05)。结论白念珠菌菌丝体外诱导可增加小鼠BMDM细胞基础自噬流中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的转换。

摘要：目的构建早老蛋白增强子2(PSENEN)基因沉默的人永生化角质形成细胞(HaCaT)模型,探究PSENEN基因表达下调对HaCaT细胞增殖以及γ分泌酶表达的影响。方法设计3组靶向PSENEN基因的shRNA序列,与线性化的LV3-pGLV-h1-GFP-puro载体构建慢病毒重组表达质粒,经酶切及测序鉴定后,进行慢病毒的包装、纯化和滴度测定。将HaCaT细胞分为5组进行转染:shRNA1组、shRNA2组、shRNA3组分别加入含沉默PSENEN基因的shRNA1、shRNA2、shRNA3慢病毒原液,NC组加入含阴性对照shNC慢病毒原液,空白组不加病毒液。转染完成后,荧光显微镜下观察荧光表达,流式细胞仪检测转染效率。CCK8法测定HaCaT细胞增殖活性,实时荧光定量PCR(qPCR)、Western印迹法分别检测PSENEN、呆蛋白(NCT)、早老蛋白1(PS1)、前咽缺陷蛋白1a(APH1a)mRNA、蛋白的相对表达量。统计分析采用重复测量方差分析、单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果倒置荧光显微镜下观察到shRNA1~shRNA3组、NC组均有荧光表达,流式细胞仪示转染效率均达98%以上。qPCR、Western印迹法显示,与NC组(1.054±0.272、1.076±0.075)相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组PSENEN mRNA(0.187±0.010、0.163±0.022、0.174±0.009)、蛋白(0.219±0.097、0.208±0.014、0.185±0.062)表达均显著降低(均P0.05);shRNA2、shRNA3组在0、12、24、36、48、60 h细胞增殖水平均显著高于NC组(均P0.05),mNCT、imNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白相对表达差异有统计学意义(F值分别为39.268、5.929、27.842、20.663,均P≤0.01)。与NC组相比,shRNA1、shRNA2、shRNA3组mNCT、PS1-CTF、APH1a蛋白表达均显著降低(均P0.05)。结论成功构建了PSENEN基因沉默的HaCaT细胞模型,PSENEN基因沉默会引起HaCaT细胞增殖活性增强,γ分泌酶其他亚基蛋白含量下降。

摘要：目的探讨nicastrin(nct)基因对斑马鱼黑素细胞生物学功能的影响。方法利用吗啉代寡核苷酸(MO)技术针对斑马鱼nct基因mRNA设计nct-MO序列,同时设计对照MO序列(ctrl-MO),并构建5′端为MO靶序列的增强绿色荧光蛋白(EGFP)mRNA,通过显微注射的方式将nct-MO或ctrl-MO与EGFP mRNA共注射入斑马鱼胚胎中,验证nct-MO的沉默效率,观察其表型变化。以野生型斑马鱼作为空白对照组,实时荧光定量PCR检测黑素合成notch信号通路相关基因mitfa、tyr、tyrp1a、tyrp1b、dct、pmela、notch1a、notch1b、hey1 mRNA表达水平的变化。多组间均数比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验。结果斑马鱼受精后8 h,ctrl-MO+EGFP mRNA组斑马鱼胚胎中均有绿色荧光表达,而nct-MO+EGFP mRNA组及空白对照组胚胎均未见绿色荧光。受精后48 h,nct-MO组幼鱼尾部色素沉着区面积占比(0.169±0.083)低于ctrl-MO组(0.258±0.042,t=3.202,P=0.005),且nct-MO组色素分布紊乱。实时荧光定量PCR显示,nct-MO组、ctrl-MO组、空白对照组间pmela、tyrp1a、hey1基因mRNA相对表达量差异有统计学意义(均P0.05);nct-MO组pmela、tyrp1a相对表达水平(0.708±0.028、0.558±0.136)低于ctrl-MO组(1.023±0.142、1.016±0.134,均P<0.05)。结论nct基因可能通过调控斑马鱼黑素合成影响黑素细胞生物学功能。

摘要：黑素瘤是高死亡率的皮肤肿瘤,鉴定出与黑素瘤发病及进展相关的蛋白质有助于阐明黑素瘤的发病机制,临床上应早期诊断以提高疗效.近年来,比较蛋白组学、蛋白质表达谱等多种蛋白质组学研究方法应用于黑素瘤发病机制的研究,有助于明确相关细胞信号通路蛋白的功能,阐明肿瘤耐药机制、发现可能的肿瘤标记物以利于早期诊断、判断疗效和预后.

摘要：目的 构建Nicastrin（NCT）基因的RNA干扰慢病毒表达载体，并在人永生化角质形成细胞（HaCaT细胞）上鉴定其沉默效率，构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型，为后续研究NCT基因下调对角质形成细胞的生物学行为影响奠定实验基础。方法 设计3个靶向NCT基因特异性短发卡RNA（shRNA）表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H1/GFP ＋ Puro中，成功构建慢病毒重组表达质粒，并通过测序鉴定。将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞，产生慢病毒颗粒，并测其滴度。将HaCaT细胞分为空白组（未感染病毒）、阴性对照组（NC组，感染空载病毒LV3-shNC）和干扰组（感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒）。流式细胞仪检测慢病毒转染效率，实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western印迹检测靶基因的沉默效率，筛选出沉默效果最佳的干扰序列。结果 测序表明，NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功。重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后产生的慢病毒颗粒滴度为109 TU/ml。慢病毒感染HaCaT细胞后，流式细胞仪检测，慢病毒转染效率大于95%。qRT-PCR结果，与NC组相比，干扰组NCT mRNA表达量明显下降，其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳，干扰效率达到75%。Western印迹结果，与NC组相比，shRNA1组NCT蛋白表达抑制率为71.7%。结论 成功筛选出高效NCT-shRNA干扰序列，构建NCT-shRNA慢病毒重组表达载体，并构建NCT基因稳定下调的人永生化角质形成细胞模型。