摘要：目的建立一种可用于日本血吸虫特异性基因片段检测的重组酶介导的核酸等温扩增方法(RAA)。方法以日本血吸虫SjG28基因片段作为靶序列,根据RAA反应原理设计合成引物,建立并优化RAA反应体系。应用此方法与聚合酶链式反应(PCR)同时扩增梯度稀释的含不同拷贝数的SjG28基因片段TA克隆质粒及不同浓度的基因组DNA,以评价其敏感性;应用此方法检测曼氏血吸虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA及健康人血基因组DNA,以评价其特异性。结果建立的RAA法可特异性扩增日本血吸虫中国大陆株成虫及虫卵基因组DNA,反应可在30 min内完成。以重组质粒为模板,RAA法最低可检出的质粒拷贝数为20个/μL;以基因组DNA为模板,RAA法最低可检测浓度为0.01 ng/μL。建立的RAA法以健康人全血基因组DNA及曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫、十二指肠钩口线虫基因组DNA为模板的扩增结果均为阴性。结论本研究建立了一种反应快捷、敏感性和特异性均较高的RAA方法,其具有应用于日本血吸虫病基因诊断的价值。

摘要：目的结合重组酶介导的核酸等温扩增(recombinase aided amplification, RAA)和荧光探针方法建立日本血吸虫特异性基因片段的快速检测方法。方法以日本血吸虫G28 (Sj G28)基因片段作为靶序列,应用DNAMAN 7.0软件设计合成引物及荧光探针,建立荧光RAA反应体系。扩增不同拷贝数的Sj G28重组质粒,评价荧光RAA检测的敏感性;分别以日本血吸虫、曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫、华支睾吸虫基因组为模板进行荧光RAA检测,以评价该方法的特异性。采用荧光RAA分别检测500、 200和50条日本血吸虫尾蚴感染的兔粪中虫卵DNA。分别在50只阴性钉螺中混入1、 2、 3、 4、 5、 10只阳性钉螺,并提取DNA进行荧光RAA检测。结果以不同拷贝数的Sj G28重组质粒为模板进行荧光RAA扩增,在5 min时即可观察到明显的荧光信号,随着拷贝数的不断降低,检测到荧光信号的时间也随之延长,不同拷贝数的扩增均在10 min内完成,最低可检出的质粒浓度为10拷贝/μl。以曼氏血吸虫、细粒棘球绦虫、十二指肠钩口线虫、似蚓蛔线虫及华支睾吸虫基因组DNA为模板的荧光RAA扩增结果均为阴性。不同数量尾蚴感染的兔粪中提取的DNA样品经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在15 min内完成。含不同数量阳性钉螺的50只阴性钉螺提取的日本血吸虫DNA经荧光RAA检测,均能得到有效的扩增,检测可在10 min内完成。结论本研究建立的可检测日本血吸虫核酸片段的荧光RAA方法,反应快捷,敏感性和特异性均较高。

摘要：目的研发羊粪收集袋,在简便易行、避免污染的前提下提高羊粪样本收集的准确性和完整性;改良塑料杯顶管孵化法,使其操作简便规范,具有较强的可比性,以适应羊日本血吸虫病病原学诊断和科学研究的需要。方法基于湖区山羊体形特征,采用棉纱粗平布面料设计缝制一种可固定在羊臀部、可脱卸、可避免尿液污染(粪尿分离)的羊粪收集袋。在进行羊粪塑料杯顶管孵化前,采用机械法代替常规人工捣碎羊粪标本,比较机械捣碎处理对顶管孵化法孵化毛蚴的影响。在塑料杯顶管孵化法顶管与杯盖橡皮圈之间加一滤膜,以阻挡粪渣漂浮物进入顶管,比较薄层脱脂棉滤膜、厚层脱脂棉滤膜、100孔/25.4 mm^2尼龙绢和150孔/25.4 mm^2尼龙绢等4种滤膜对毛蚴孵出观察的影响。结果羊粪收集袋由前腿固定衫、后腿固定衫和粪便袋3部分构成,固定衫主要功能是固定收集袋,使其在羊活动时不移位且能承载重量,粪便袋主要功能是存放粪便。携带粪便收集袋的山羊活动不受影响,所排放粪便均落入袋中,并可按需要随时取用。该袋装卸方便,粪便标本可避免尿液污染,收集袋可在清洗后重复使用。羊粪样本用于塑料杯顶管毛蚴孵化法前,加适量水后采用JYL-C16V型九阳牌料理机,按18 000 r/min搅碎10 s,连续3次,每次间隔5 s,可将山羊粪便标本均匀粉碎,采用该法机械搅碎羊粪对毛蚴孵化无影响。同一份羊粪标本用于塑料杯顶管孵化法时,在顶管与橡皮圈间分别加垫100孔/25.4 mm^2尼龙绢、150孔/25.4 mm^2尼龙绢、薄层脱脂棉滤膜和厚层脱脂棉滤膜后,获得毛蚴总数分别为541、620、344条和211条,表明采用100孔/25.4 mm^2尼龙绢和150孔/25.4 mm^2尼龙绢观察效果均好。结论羊粪收集袋操作方便、适用、可重复使用,可用于山羊血吸虫感染病原学诊断和科学研究;用机械搅碎和150孔/25.4 mm^2尼龙绢改良塑料杯顶管法的相关操作,可提高山羊日本血吸虫病原学检测的方便性和准确性。