摘要：Bt Cry毒素是当前研究最深入、应用最广的生物抗虫蛋白,对农业害虫的绿色防治发挥了重大作用。然而,随着其制剂和转基因抗虫作物的广泛应用,由此驱动诱发的靶标害虫抗药性及潜在生态安全风险等问题日益凸显。探寻具备模拟Bt Cry毒素杀虫功能的新型抗虫蛋白材料,不仅可为农作物持续健康生产保驾护航,也能在一定程度上缓解靶标害虫对Bt Cry毒素的抗药性压力。近年来,笔者团队以抗体“免疫网络学说(immune network theory)”中Ab2β类型抗独特型抗体(anti-idiotype antibody, Anti-Id)具备模拟抗原结构和功能的特性为理论依据,借助噬菌体展示抗体库及特异性抗体高通量筛选与鉴定技术,设计Bt Cry毒素抗体为包被靶点抗原,从噬菌体抗体库中靶向筛选到了一系列具备模拟Bt Cry毒素抗虫功能的Ab2β类型抗独特型抗体(即Bt Cry毒素抗虫模拟物),其中活性最强的Bt Cry毒素抗虫模拟物对靶标害虫的致死率接近相应原Bt Cry毒素的80%,初步实现了Bt Cry毒素抗虫模拟物的靶向设计。本文从理论依据、技术条件、研究现状等方面进行系统概述,并就相关技术发展趋势以及如何推进现有成果落地应用等展开深入探讨,旨在为绿色抗虫材料创新研发提供全新思路和实例参考。

摘要：从小麦根际土壤中分离得到一株对禾谷镰刀菌有拮抗作用的菌株7F1。以菌株7F1基因组总DNA为模板,通过16S rDNA和gyrB基因序列分析,鉴定7F1为多粘类芽孢杆菌。本实验对该菌种产拮抗物的稳定性进行了研究,同时,应用特异性引物对7F1中脂肽类抗生素合成相关基因进行检测。结果表明：该菌产生的拮抗物在40-90℃保持较高的活性;在蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶处理后,抑菌活性显著下降;在pH 3.0-10.0具有抑菌活性;使用已报道的脂肽类抗生素基因片段设计的引物进行聚合酶链式反应扩增,从该菌的基因组DNA中扩增得到了3种bamC、eriSa、ituC脂肽类抗生素合成酶基因。此研究结果对脂肽类抗生素进一步的分离提供了重要参考。

摘要：构建可用于特异性单链抗体(ScFv)筛选和应用的大容量鼠源噬菌体抗体展示库,获得拥有自主知识产权的抗体库材料。从小鼠脾脏细胞中提取总RNA,反转录成c DNA后,分别扩增抗体的重链基因、轻链基因,并设计2条互补的Linker基因。采用重叠延伸PCR(SOE-PCR)法将重链-Linker和Linker-轻链拼接为完整的ScFv基因,酶切、酶连后,将ScFv基因克隆到pCANTAB-5E噬菌粒载体上,经电穿孔导入*** TG1感受态细胞中,过夜培养获得初级噬菌体展示库。以单克隆菌落数计算库容量大小,通过比对随机挑取的单克隆噬菌体ScFv可变区序列的差异,分析库的多样性。以Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为包被抗原,从库中筛选具有结合活性的ScFv验证库的实用性。经检测,提取的总RNA条带清晰,浓度为2.76μg/μl,扩增的抗体重链基因、轻链基因条带清晰,且2条互补的Linker基因成功添加到重链基因和轻链基因上。经SOE-PCR法扩增,重链-Linker与Linker-轻链成功拼接为ScFv基因。电转化后,经PCR(Polymerase chain reaction)扩增和凝胶电泳检测,证实ScFv基因克隆成功,测得初级噬菌体抗体展示库的库容为3.67×10~8。随机挑取12个单克隆菌种进行测序和比对,证实ScFv基因为鼠源抗体基因,且12个单克隆菌种的ScFv基因可变区均有一定差异,说明ScFv基因具有多样性。以3种Bt毒素(Cry1B、Cry1C、Cry1F)为抗原,经4轮特异性富集筛选后均获得了具有抗原结合活性的噬菌体ScFv菌种,表明该库的实用性较强。

摘要：抗独特型抗体制备技术是开发新型抗虫蛋白资源的一项创新策略。为设计构造以基因工程抗体为基础的杀虫蛋白资源,制备了对小菜蛾(Plutella xylostella)具有杀虫活性的猪、牛源改型单链抗体(single chain variable fragment,sc Fv)。通过NCBI数据库搜索猪、牛源抗体重、轻链可变区的8个骨架区,在其中植入人源抗独特型sc Fv 3E1的6个互补决定区,并进行人工合成及替换成噬菌体展示表达载体p IT2;利用间接竞争ELISA对动物源化改型sc Fv进行分型鉴定;利用表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)技术分析动物源化改型sc Fv与小菜蛾刷状缘膜囊泡(brush border membrane vesicles,BBMV)的结合能力;采用浸叶法测定动物源化改型sc Fv对小菜蛾的生物活性。通过替换表达载体获得了猪源swine-3E1-p IT2质粒和牛源bovine-3E1-p IT2质粒,结果显示:swine-p IT2和bovine-p IT2表达上清液对Cry1B与其多克隆抗体(p Ab)结合的抑制率分别为44.3%和43.0%,模拟抗原Cry1B的某些结构功能,发现两者均属于β型抗独特型sc Fv。SPR分析发现,swine-p IT2、bovine-p IT2与小菜蛾BBMV的结合能力分别为209.48和195.31 RU。生物活性测定结果显示,改造后的swinep IT2和bovine-p IT2对小菜蛾幼虫均具有杀虫活性,LD_(50)值分别为5.90×10^(7)和6.22×10^(7)CFU/m L,均低于亲本3E1的6.86×10^(7)CFU/m L;并且改造后2种材料的毒力回归方程的斜率分别为1.50和1.48,均高于3E1(1.23)。综上,动物源化swine-p IT2和bovine-p IT2改型sc Fv属β型抗独特型sc Fv,能够与小菜蛾的BBMV结合,且具有杀虫活性,为新型生物农药蛋白资源挖掘提供了新的思路。

摘要：为了建立一种能够鉴别检测裂谷热病毒野毒株与NSs缺失型疫苗株的荧光定量RT-PCR方法,本研究通过对裂谷热病毒基因组序列进行比较分析,选择其S节段NSs基因及L节段L基因的无二级结构且保守的区段,分别设计多对引物和探针,通过试验验证并优化反应条件,筛选出最佳引物和探针的组合,建立了可以快速检测裂谷热病毒并区分NSs基因缺失疫苗株和野毒株的双重荧光定量RT-PCR方法。利用该方法检测羊临床常见病原,结果显示该方法仅对裂谷热质粒标准品样品检测为阳性,不与羊常见的其他病原出现阳性反应,特异性强;将裂谷热质粒标准品10倍倍比稀释后利用本研究建立的方法进行检测,结果显示,该方法对NSs和L基因重组质粒标准品的检测下限分别为10拷贝/μL和100拷贝/μL,敏感度高;重复性实验结果显示,该方法组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。将NSs缺失型和非缺失型质粒分别转染细胞,提取核酸,利用本方法进行检测,结果显示该方法可有效区分NSs基因缺失型和非缺失型核酸样品。本研究建立的双重荧光定量RT-PCR方法为鉴别野生病毒株和NSs缺失型疫苗株奠定了技术基础。

摘要：Bt毒素是苏云金芽孢杆菌产生的一类生物大分子蛋白质,对多种常见的农林害虫甚至卫生媒介蚊虫都有特异性毒杀活性,是具备重大经济价值和生态环境效益的绿色抗虫材料。然而,随着Bt毒素制剂和转基因抗虫作物长期应用,致使靶标害虫抗药性进化加快,并对非靶标生物的交互毒性等潜在风险加大,因此对其残留监测成了农业食品和环境安全风险评估的重要内容。本研究梳理了Bt毒素传统的依托微生物表达体系的制剂和植物表达体系的转基因抗虫作物应用及其对靶标害虫抗药性和非靶标生物交互毒性潜在风险的研究现状,概述了针对Bt毒素残留分析的免疫检测研究进展;并结合本研究团队近年来依托热门的噬菌体展示抗体库技术,在Bt毒素特异性基因工程抗体创制以及Bt毒素抗虫模拟物靶向设计等方面的最新研究成果,探讨了基于Bt毒素的新型安全杀虫蛋白质创新研发与应用策略及其毒素蛋白质残留检测技术创新等未来潜在发展动向和可行捷径,为进一步围绕Bt毒素的相关研究提供有价值的文献资料和新的思路。

摘要：生物膜修复技术凭借其高效性、安全性和经济性,已被广泛应用于土壤中难降解污染物的去除。其中,群体感应效应在生物膜修复过程中起着至关重要的作用。群体感应是微生物普遍存在的细胞间通讯形式,有助于生物膜内不同细菌种内/种间的信息交流,使微生物能够在“群体水平”上相互协作,能够调控生物膜胞外聚合物的生成以及对污染物的吸附固定与降解。本文在简要介绍生物膜和群体感应的功能和作用基础上,结合近年来群体感应调控生物膜形成以及对污染物的降解基础上,综述了群体感应在生物膜修复技术中的应用,最后对生物膜群体感应系统在污染土壤修复中的工程化设计进行了展望。

摘要：前期分离得到1株具有较强裂解能力的金黄色葡萄球菌噬菌体vB_SauM_JS25。测序后发现,噬菌体vB_SauM_JS25的裂解酶基因LysJS25与裂解酶LysK同源性最高,且可以广谱裂解金黄色葡萄球菌。为提高LysJS25细胞穿透效果,设计了穿透肽嵌合裂解酶LysJS25-R9,经原核表达和纯化,体外评价了LysJS25-R9裂解活性、细胞穿透活性及细胞内杀菌活性。结果表明:LysJS25-R9对葡萄球菌表现出较好的裂解能力,杀菌效率较原裂解酶提高2.1倍。激光共聚焦及细胞内杀菌活性实验证实LysJS25-R9进入MAC-T细胞内杀菌。该研究为穿透肽嵌合裂解酶的设计提供了一个良好的例证,同时有助于裂解酶细胞穿透性改造的设计。

摘要：害虫是威胁农作物生长发育及产品品质的主要风险因素,对其有效防治是保障农作物稳定生产的重要环节。传统依赖化学农药对害虫防治效果显著,但化学农药本身对非靶标生物以及生态环境所造成的持久性危害风险也同样突出。害虫绿色防治是农业可持续发展的必然要求,其中具杀虫功能的蛋白类生物材料因兼具安全性高、可量产药剂及可在转基因抗虫作物应用的多重优势,是害虫绿色防治创新研发和应用的热点。如具备杀虫功能的Bt毒素、凝集素、动物毒素、防御素、蛋白酶抑制剂等蛋白类生物材料在害虫防治上已有深入研究和广泛应用;此外,近年来包括杀虫抗体在内的一些新型杀虫蛋白和相应创新技术也不断涌现,发展极为迅猛。基于此,本文在系统梳理当前成熟的具杀虫功能的蛋白类生物材料研发和应用现状的基础上,结合作者团队在杀虫抗体靶向设计上取得的原创性研究成果和经验,对蛋白类生物杀虫材料潜在的创新研发与应用进行展望,旨在为农业害虫绿色防治研究提供最新文献资料和技术参考。

摘要：本研究拟通过模拟Cry毒素创制新型杀虫蛋白质用于小菜蛾防治,主要利用三维结构模拟及分子对接技术,以前期获得的抗Cry1Ab抗体为模板设计2个基因工程抗体(GEAb)。其中,具有杀虫活性的GEAb-GGCC与小菜蛾中肠刷状边缘膜囊泡(BBMV)具有较高结合活性,并与Cry1A和Cry1B具有重叠的BBMV结合位点。BBMV免疫沉淀分析鉴定结果显示,与GEAb-GGCC结合的中肠蛋白质包括氨肽酶N(APN)、V-ATP酶B亚基和polycalin。由于GEAb-GGCC缺乏Cry1A类蛋白质中负责成孔的α-螺旋结构,推测GEAb-GGCC或通过结合小菜蛾中肠受体激活下游信号通路,引起中肠损伤,导致虫体死亡。