摘要：为明确2株SVA广西分离株的生长特性以及与其他毒株的同源关系,进一步了解其致病性,以GX84/2020和GX94/2020为研究对象,参考GD05/2017(MH316116)毒株全基因组序列设计4对覆盖全长的引物,通过RT-PCR扩增、测序和拼接,得到GX84/2020(MW117128)和GX94/2020(MW117129)毒株的全长基因组序列后进行序列分析;并将其攻毒8~10周龄仔猪。结果表明:GX84/2020和GX94/2020毒株基因组全长7250bp,同源性分析显示这2个广西分离株与其他43株SVA毒株的同源性为93.2%~98.1%;系统发育分析表明GX84/2020和GX94/2020毒株与美国毒株SVA-OH2(KU058183)亲缘关系最近,同源性为98.1%。攻毒结果显示,部分仔猪出现口蹄部位水疱、跛行及体温升高等临床症状,整个过程未出现仔猪死亡。通过全基因组序列分析和动物试验,明确了GX84/2020和GX94/2020分离株的生长特性、与其他毒株的同源关系以及该毒株的致病性,为研发疫苗和抗病毒药物奠定了基础,且丰富了SVA的基因组信息数据库。

摘要：目的利用CRISPR/Cas9系统构建精子特异性磷脂酶C zeta-1(phospholipase C zeta1,Plcz1)基因敲除(Plcz1)小鼠模型,探讨Plcz1基因在雄性小鼠生育过程中的作用。方法选择小鼠Plcz1基因第6、7外显子作为靶位点,前后两个位点设计2对sgRNA序列,再将2对sgRNA以Golden Gate方法插入pX330A质粒中,构建pX330-sgRNA重组质粒。经扩增、纯化后,将重组质粒显微注射进小鼠受精卵原核中,进行胚胎移植至代孕母鼠,F0代小鼠出生后,提取其尾DNA进行PCR鉴定和DNA测序分析。通过F0代与野生型小鼠交配得到F1代小鼠,F1代交配繁殖至F2代获得Plcz1基因缺失的小鼠纯合品系,Plcz1与野生型小鼠交配,分析Plcz1雄鼠的生育能力。结果成功构建pX330-sgRNA重组质粒,通过繁育和测序筛选获得3只Plcz1雄鼠(Plcz1、Plcz1、Plcz1),对3只小鼠进行目的基因测序发现:(1)Plcz1:Plcz1基因第6、7外显子区域缺失3078 bp;(2)Plcz1:第7外显子区域缺失7 bp,该小鼠在饲养过程中死亡;(3)Plcz1:Plcz1基因第6外显子区域缺失1 bp。结论利用CRISPR/Cas9,成功获得Plcz1雄性小鼠,Plcz1雄性小鼠可育,但与野生型小鼠相比,其生育能力明显下降。

摘要：为提高我国中小规模家禽养殖户疫病防控水平,推进“互联网+”现代农业,开发了基于Android和iOS移动平台的“养鸡手册”APP。该APP基于SQLite的移动端禽病信息数据库,将归档文件按照禽病诊断数据模型进行解档和存储,若数据模型内禽病临床症状部位以及症状与用户添加内容重合,则将此禽病诊断数据模型保留而显示出来。初步应用结果表明,应用程序界面清晰、操作便捷,可根据常见临床症状作出初步诊断,为家禽疾病的便捷诊断提供了参考。

摘要：为建立快速有效的猪人住肉孢子虫检测技术,保证猪及其肉产品的公共卫生安全,以感染猪人住肉孢子虫阳性猪的肌肉组织DNA为模板,扩增18S rRNA基因片段,针对该基因高保守区设计并筛选出1对外引物F3、B3与1对内引物FIP、BIP,建立环介导等温核酸扩增(LAMP)检测技术并初步应用。结果显示,建立的LAMP检测技术特异性强,与常见的猪寄生虫无交叉反应;且敏感性好,对虫体18S rRNA基因的最低检出限为10 copies。临床实际应用结果显示该检测方法效果良好,为临床上猪人住肉孢子虫的检测提供了一种简便快速的方法,值得进一步推广。

摘要：【目的】构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因(GenBank登录号:KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR质粒;通过XbaⅠ和EcoRⅠ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切,构建pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp;pMD19-T-NMBR重组质粒双酶切为2条特异性条带,条带大小分别与pMD19-T质粒和猪NMBR CDS序列片段大小一致,表明成功构建pMD19-T-NMBR质粒;通过双酶切获得线性化的pCD513B-1和NMBR序列;RT-PCR和测序结果表明,成功构建慢病毒过表达载体pCD513B-1-NMBR;pCD513B-1-NMBR转染48 h后,HEK-293T细胞中呈现大量绿色荧光,表明病毒包装成功,病毒效价约为4×10~6 TU/mL;NMBR基因慢病毒转染猪Leydig细胞48 h后,80%以上细胞有GFP表达,表明大部分细胞成功转染慢病毒;实时荧光定量PCR检测结果表明,转染慢病毒后能够极显著增加NMBR mRNA的表达(P<0.01)。【结论】本试验成功构建了猪NMBR基因慢病毒过表达载体,并证实猪NMBR基因过表达慢病毒能够增加猪Leydig细胞NMBR基因的表达,为研究NMBR基因过表达在猪Leydig细胞中的作用奠定基础。

摘要：针对非洲猪瘟病毒B646L、MGF505-2R和CD2v基因分别设计了引物和探针,经过条件优化,建立了基于TaqMan探针技术的三重荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的三重荧光定量PCR检测方法与猪场常见病毒的核酸不发生交叉反应,具有良好的特异性;敏感性分析显示,针对B646L、MGF505-2R和CD2v基因的最低检测下限分别为6.5,8.0和14.0 copies/μL;并且该方法在10~10copies/μL模板范围内具有良好的线性关系,组间变异系数为0.05%~2.68%,组内变异系数为0.10%~1.17%,稳定性良好。进一步针对临床核酸样品的检测显示,本方法和OIE推荐的检测方法具有良好的一致性。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的荧光定量PCR鉴别检测方法,为临床非洲猪瘟病毒的监测诊断提供了良好的技术支撑。

摘要：本文设计合成了氟化超支化聚酰胺-胺并研究其作为流感DNA疫苗递送载体的能力。首先采用迈克尔加成反应合成超支化聚酰胺-胺聚合物[hyperbranched poly(amido amine)s,HP],并进行氟化修饰(fluorinated HP,F-HP)通过设计特异性引物扩增目的基因,构建流感病毒PR8的核蛋白(nucleoprotein,NP)基因真核表达质粒,作为DNA疫苗,F-HP与NP质粒通过静电作用形成纳米复合物(F-HP/NP)。结果表明:所合成的HP的分子质量为59.7 kDa多分散系数(polydispersity index,PDI)为2.67,F-HP中氟元素的含量为20%(质量比,w/w),聚合物能与NP质粒络合形成球形的纳米粒。聚合物与DNA质量比为5~10时,纳米复合物的粒径分布在100 nm左右,并随质量比的升高而减小。氟化修饰有利于提高纳米复合物的细胞摄取及溶酶体逃逸能力,进一步提高NP的细胞内表达水平。体内免疫实验表明,与HP/NP纳米复合物相比,氟化修饰的F-HP/NP纳米复合物对CD8^+T细胞具有更强的免疫应答诱导效应。以上结果说明氟化修饰的超支化聚酰胺-胺作为DNA疫苗载体具有可行性。动物实验经扬州大学大学实验动物伦理委员会批准。

摘要：该文设计了一个涉及兽医传染病学、兽医分子生物学等兽医学科专业的探索性实验——鸡马立克病毒meq基因克隆及遗传进化分析实验。实验内容包括通过全自动核酸提取仪、荧光定量PCR仪对鸡组织病料中马立克病毒核酸进行检测,在确定病毒核酸阳性的基础上通过分子生物学手段扩增特征毒力基因meq序列,通过与Genbank已报道的30多株参考毒株序列进行比对,分析该病例马立克病毒的分子特征及遗传进化特点。该实验可锻炼学生的实验动手能力,加深对兽医学相关内容的理解,激发对专业知识的兴趣。

摘要：为测定塞内卡病毒(SVA) GD05/2017株的全基因组序列,并构建其感染性克隆,根据GenBank公布的塞内卡病毒全基因序列设计引物,将分离的塞内卡病毒毒株GD05/2017全基因组划分为4个片段进行PCR扩增,并进行序列测定与分析。利用酶切连接和同源重组的方法,将基因片段依次克隆至pEGFP-C3载体中,构建该毒株的全长cDNA克隆pC3-SVA-GD05。将pC3-SVA-GD05转染BHK-21细胞,拯救病毒。结果表明:该毒株基因组全长7 251 bp,开放阅读框为6 543 bp,编码2 181个氨基酸, 5′和3′非编码区分别为650和58 bp。VP1核苷酸序列的遗传进化树分析表明,该毒株与China/HN16处于同一分支。将pC3-SVA-GD05转染BHK-21细胞, 72 h后收集细胞培养上清,然后将上清接种ST-R细胞,可观察到明显的细胞病变。拯救病毒的间接免疫荧光结果表明成功拯救出具有感染性的SVA。拯救病毒与亲本病毒的生长动力学曲线及空斑试验表明两者具有相似的复制能力和生长特性。这一研究构建了塞内卡病毒的感染性克隆并成功拯救出病毒,为深入研究SVA的致病机制及开发疫苗提供了有效的反向遗传操作平台。

摘要：兽医外科学与手术学是农业本科院校动物医学专业一门重要的基础课程,也是一门实践性很强的学科。笔者从课程定位、教学大纲、教学方式、实践教学等几个方面介绍了课程教学的改革方法,并进行了探讨,供参考。