摘要：【目的】为了实现对新冠病毒一步法检测。【方法】采用RT-LAMP技术,利用具有反转录酶活性的Bst3.0 DNA聚合酶,以新冠病毒N蛋白基因为模板设计LAMP引物,成功建立了以新冠N蛋白基因为靶基因的RT-LAMP检测方法。同时对反应条件中的温度、镁离子浓度、NTP浓度、甜菜碱浓度以及酶浓度进行优化。通过加入钙黄绿素和氯化锰显色剂对反应结果进行判定,用ASFV p54质粒和JEV NS1质粒与稀释后模板做对照。【结果】温度为66℃,镁离子浓度为6mmol/L,甜菜碱浓度为1 mol/L,NTP为1.4 mmol/L,酶浓度为160 U/L为最优反应条件。【结论】证明了Bst3.0 DNA聚合酶对新冠N蛋白基因检测是成功的,该方法具有良好的特异性以及灵敏度。

摘要：利用环介导等温扩增技术(LAMP),根据非洲猪瘟病毒(ASFV)ASFV p72基因保守序列设计一组LAMP引物。采用单因素试验,对影响LAMP反应的5个重要因素反应温度、甜菜碱浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、Bst 3.0 DNA聚合酶浓度进行优化,使用钙黄绿素-MnCl2显色液进行可视化判定,并进行灵敏度和特异性检测。结果表明,优化后的LAMP反应可检测低至103拷贝/μL的ASFV模板,且具有良好的特异性。反应体系中各成分的最佳浓度分别为甜菜碱1.25 mol/L、Mg2+8 mmol/L、dNTPs 1.25 mmol/L、Bst 3.0 DNA聚合酶320 U/mL,最佳反应温度为67℃。试验成功建立了ASFV LAMP可视化检测方法,适合猪场和农户进行ASFV的现场快速检测。