摘要：目的构建微小脲原体UP3-00750基因的原核表达载体,对其编码的蛋白进行表达并进行生物信息学分析。方法利用Primer Premier 5.0软件设计引物,利用PCR方法扩增UP3-00750基因,经限制性内切酶双酶切后与同酶消化的pGEX-6p2于16℃在T4连接酶作用下连接16 h,连接产物转入大肠埃希菌XL1-Blue中,IPTG诱导GST-UP3-00750融合蛋白的表达,并采用相关生物信息学软件对其进行分析。结果对构建的pGEX-6p2-UP3-00750重组质粒测序,所得序列与NCBI中序列比对,与*** strain hebnu uu3序列的同源性为100%。诱导的融合蛋白经SDS-PAGE分析显示其分子质量与GST-UP3-00750融合蛋白的预期大小一致。生物信息学分析该假设蛋白由159个氨基酸组成,分子式为C_(86)0_(H1369)N_(223)O_(254)S_(2),理论等电点(pI)为6.43,不稳定指数为36.70,脂肪族指数为112.14;其二级结构中α-螺旋(Hh)占39.62%,β-折叠(Ee)占19.50%,无规则卷曲(Cc)占40.88%,无β-转角;属于无信号肽的跨膜蛋白;蛋白质互作提示该基因编码的蛋白与atpA-1、atpD-1、UU044、UU045、UU046、UU047、UU048、UU049、UU050、UU052相关联。结论成功构建了GST-UP3-00750原核表达载体,在大肠埃希菌中表达GST融合蛋白。该蛋白为无信号肽的跨膜蛋白,可能参与ATP合成代谢途径。

摘要：目的采用茎环-逆转录实时荧光定量PCR方法,鉴定高脂饲料诱导的胰岛素抵抗小鼠肝脏组织中差异表达的mircoRNAs(miRNAs),即miR-1897-3p、miR-690和miR-7a-5p,并预测分析miRNAs调控的靶基因和功能,探讨胰岛素抵抗与差异表达的miRNAs的相关性。方法 30只雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和高脂饲料诱导的胰岛素抵抗模型组,设计茎环引物和实时荧光定量PCR特异引物,建立茎环-逆转录SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,检测小鼠肝脏组织中miR-1897-3p、miR-690和miR-7a-5p的表达。统计学分析小鼠miR-1897-3p、miR-690和miR-7a-5p表达的差异。利用生物信息学软件预测miRNAs调控的靶基因,分析靶基因富集的基因功能(gene ontology,GO)和涉及到的信号转导通路及其靶基因蛋白的相互作用。结果经实时荧光定量PCR鉴定分析,与对照组相比,胰岛素抵抗组小鼠肝脏组织中miR-1897-3p、miR-690、miR-7a-5p表达下调(P<0.05)。生物信息学分析结果显示,有16种靶基因被两种差异表达的miRNAs调控,其中有8个靶基因可与4种以上的蛋白质相互作用,Rac1、Rhoa、Prkcz、Tgfbr2、Itch和Ube2d3蛋白位于网络的中心节点,且它们与胰岛素信号通路相关或存在交联。结论肝脏miR-1897-3p、miR-690和miR-7a-5p可能参与了胰岛素抵抗的病理生理过程,其机制可能通过调节靶基因的表达,影响了胰岛素信号通路的正常级联反应。

摘要：目的构建微小脲原体UP3-00235基因的原核表达载体,并对其编码蛋白质进行生物信息分析。方法利用Primer Premier 5.0软件设计引物,利用PCR方法克隆UP3-00235基因(片段大小为483bp)。使用限制性核酸内切酶双酶切UP3-00235基因和pGEX-6p-2载体质粒,室温下用T4连接酶连接2.5h,连接后转入大肠埃希菌感受态中,IPTG诱导GST-UP3-00235蛋白的表达,并对其进行生物信息学分析。结果成功构建了pGEX-6p-2-UP3-00235重组质粒,测序后与NCBI中已录入的Ureaplasma parvum strain hebnu uu3序列进行比对,同源性100%。重组质粒转染大肠埃希菌后经IPTG诱导3h,表达出GST-UP3-00235融合蛋白,与预期大致相符。经生物信息学软件分析,UP3-00235基因编码蛋白质含有160个氨基酸,分子式为C823H1339N241O251S3,相对分子质量为18.73×103,等电点(PI)为9.43。二级结构中含有α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲,分别占59.38%、17.50%和23.12%。无β-转角和跨膜区域,但含有信号肽区域。高级结构分析显示,UP3-00235基因编码蛋白分子与蛋白库中3r3t.1蛋白的B链相似性高,为36.56%;结构及功能预测显示该蛋白为UU-554,rpS6,与其相邻的蛋白分别为rpS18和rpL9。结论成功构建了GST-UP3-00235原核表达载体,并诱导表达45×103的目的蛋白,生物信息学预测该蛋白含有信号肽,属于核蛋白家族,为进一步研究微小脲原体UP3-00235基因的功能奠定了基础。

摘要：目的构建ACBD3基因片段真核表达载体并表达蛋白,为研究其与肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308/Cpn0147相互作用的分子机制奠定基础。方法根据与肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308/Cpn0147作用的配体核苷酸序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,通过PCR获得ACBD3基因片段,与pcDNA3.1+/Flag质粒经双酶切后在T4连接酶作用下连接,构建表达载体pcDNA3.1+/Flag-ACBD3,经菌落PCR、双酶切及质粒测序鉴定后转染HeLa细胞,采用Western blot与间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 PCR扩增目的基因片段约883bp,与预期相符。经菌落PCR、双酶切验证及测序分析重组质粒构建成功。间接免疫荧光法检测重组质粒转染后的HeLa细胞,观察到表达的蛋白位于细胞胞浆;SDS-PAGE检测表达蛋白分子质量单位(Mr)为33.5×10~3,与预期相符。结论成功构建了pcDNA3.1+/Flag-ACBD3真核表达载体并实现目的蛋白的表达,为进一步研究其生物学功能及其与肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308/Cpn0147之间的相互作用奠定了基础。

摘要：目的构建解脲脲原体UP3_c0006基因原核表达载体并表达蛋白。方法根据NCBI上公布的解脲脲原体UP3_c0006基因序列设计上、下游引物,以解脲脲原体基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因,采用经酚氯仿法回收、纯化。BamHI和NotI酶分别对目的基因和原核表达载体pGEX-6P-2进行双酶切,酶切片段在T4连接酶作用下连接,连接产物经热休克法转化感受态大肠埃希菌XL1-Blue。转化菌接种至含氨苄青霉素的LB固体培养基过夜培养,进行菌落PCR筛选及测序验证。重组质粒转化菌用IPTG诱导3h,超声裂解菌体经GST Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白GST-UP3_c0006并进行SDS-PAGE鉴定。结果 PCR扩增UP3_c0006基因片段长327bp,构建的UP3_c0006原核表达载体转化XL1-Blue后进行菌落PCR鉴定,目的片段约为477bp,与预期相符。对重组菌扩大培养并提取质粒进行基因测序,结果与NCBI中UP3_c0006基因序列完全一致;诱导表达的重组蛋白纯化后进行SDS-PAGE鉴定,融合蛋白GST-UP3_c0006分子质量单位约为38×103,与预期相符。结论成功构建了pGEX-6P-2-UP3_c0006原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得融合蛋白的表达,该蛋白主要存在于重组菌超声裂解上清中。

摘要：目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析。结果肺炎衣原体Taqman FQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg^(2+)4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3%。自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10%vs 10%(χ~2=0.167,P>0.05),44.44%vs 40.74%(χ~2=0,P>0.05),6.67%vs 3.33%(χ~2=0,P>0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54%vs 14.96%)比较差异无统计学意义(χ~2=0.071,P>0.05)。结论本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测。