摘要：目的探讨并建立非专业实验室场景下恒温、快速及简便的检测副溶血性弧菌的方法.方法本研究针对副溶血性弧菌toxR基因设计特异性引物和成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)RNA(crRNA),建立基于重组酶聚合酶扩增(RPA)结合CRISPR及其相关蛋白13a(CRISPR-Cas13a)的反应体系,采用自配十二烷基硫酸钠(SDS)核酸快速提取试剂提取样本全基因组,并结合荧光法实现检测结果的可视化判读.结果利用副溶血性弧菌菌株ATCC 17802和其他3种非副溶血性弧菌(溶藻弧菌、河流弧菌和梅氏弧菌)以及3种临床上常见腹泻致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌)对RPA-CRISPR/Cas13a荧光法的特异性进行验证,结果显示特异性为100.00%;对副溶血性弧菌基因组DNA进行倍比稀释并检测,该方法最低检出限为102 copies/μl.最后,将建立的方法应用于野生型副溶血性弧菌检测,检测结果与TaqMan定量聚合酶链式反应(TaqMan-qPCR)检测结果及基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)鉴定结果一致.结论本研究建立了一种针对toxR基因的RPA-CRISPR/Cas13a检测方法,具有简便、快速、特异性强、结果判读可视化等优点,为非专业实验室场景下的副溶血性弧菌快速检测提供了较好工具.

摘要：CRISPR/Cas9系统作为一种新型的基因组编辑技术,利用人工设计的向导RNA(singleguide RNA,sg RNA)介导外源表达的Cas9蛋白与基因组靶点特异性结合以实现对基因组DNA的特异性切割,切割后的基因组DNA通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复,从而实现基因的敲除、敲入等。MEIS2属于一类高度保守的同源盒转录因子MEIS家族,研究发现,MEIS2广泛参与胚胎的早期发育及肿瘤的发生发展,但其发挥作用的机制目前还不是很清楚。该研究针对MEIS2基因作用的功能域,设计两个靶向MEIS2基因Exon3和Exon8的sg RNA,通过SURVEYOR分析及Western blot检测,确认了所设计sg RNA的有效性。进一步通过细胞分选及Western blot检测筛选出稳定敲除MEIS2基因的HEK293T细胞株。最后,通过序列测定确认MEIS2发生了移码突变。综上所述,该研究利用CRISPR/Cas9技术成功建立了完全敲除MEIS2的HEK293T细胞株,为研究MEIS2的功能和作用机制提供了有效工具。

摘要：目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析。结果肺炎衣原体Taqman FQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg^(2+)4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3%。自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10%vs 10%(χ~2=0.167,P>0.05),44.44%vs 40.74%(χ~2=0,P>0.05),6.67%vs 3.33%(χ~2=0,P>0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54%vs 14.96%)比较差异无统计学意义(χ~2=0.071,P>0.05)。结论本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测。

摘要：目的探讨小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术沉默HLA-E基因表达对人乳腺癌细胞增殖与凋亡及对裸鼠移植瘤生长的影响。方法设计并合成靶向HLA-E基因的特异性siRNA及阴性对照siRNA序列,分别转染至人乳腺癌细胞MDA-MB-231,即为HLA-E siRNA组和阴性对照组,同时设立空白对照组(不加任何试剂)。Real-time PCR法和Western blot检测各组细胞HLA-E基因及蛋白表达;CCK-8法和流式细胞术检测各组乳腺癌细胞增殖和凋亡情况。将对数生长期MDA-MB-231细胞接种于裸鼠皮下,建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型,随机分为3组:空白对照组、阴性对照组和HLA-E siRNA组,观察各组小鼠移植瘤生长情况。结果靶向HLA-E siRNA转染乳腺癌细胞MDA-MB-231后,HLA-E基因及蛋白表达明显降低;细胞增殖显著被抑制及细胞凋亡率显著增加(P<0.01);裸鼠体内实验结果显示,至接种30 d时,HLA-E siRNA组小鼠瘤组织体积显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.01)。结论siRNA技术沉默HLA-E基因表达能显著抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖,促进乳腺癌细胞凋亡,并抑制裸鼠移植瘤的生长,表明靶向沉默HLA-E基因表达可能为人乳腺癌基因治疗提供了新策略。

摘要：DEAD-box解旋酶21(DEx D-box helicase 21,DDX21)是含DEAD-box的RNA解旋酶家族成员之一,不仅参与RNA的合成和加工过程,同时还参与机体的天然免疫应答,调控病毒的复制。为了研究猪DDX21基因的结构和功能,以猪肾传代细胞(PK-15)总cDNA为模板,根据GenBank公布的预测序列(XM_005657387.2)设计引物扩增猪源DDX21基因,并采用分子生物学软件将其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果显示,首次成功克隆了猪DDX21基因的cDNA序列(GenBank登录号为KX396051),其开放读码框全长为2 355 bp,编码784个氨基酸;与牛、斑马鱼、人、小鼠、大鼠和非洲爪蟾的氨基酸序列同源性分别为91.7%,57.5%,88.0%,82.3%,83.8%和48.9%;该基因编码的蛋白结构域和人、牛、小鼠、大鼠一样,其C端都具有保守的GUCT结构域;系统进化树分析表明猪DDX21与牛DDX21的亲缘关系最近。进一步构建原核表达质粒p ET28a-DDX21,经测序鉴定正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),对DDX21基因进行原核表达。经SDS-PAGE分析显示重组菌可表达分子量约为90 k Da的融合蛋白,与预期相符;在IPTG诱导浓度一定的条件下,重组菌的最佳诱导时间为5 h。猪DDX21基因的克隆和原核表达,为进一步研究DDX21蛋白的结构和生物学功能奠定了基础。

摘要：目的应用多重聚合酶链式反应(PCR)技术,建立肺炎克雷伯菌、鲍氏不动杆菌、肺炎链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、奇异变形杆菌等临床常见病原菌的快速、高效检测方法,并应用于血培养后病原菌的检测。方法以肺炎克雷伯菌khe基因、鲍氏不动杆菌OXA基因、肺炎链球菌LytA基因、屎肠球菌和粪肠球菌ddl基因、大肠埃希菌phoA基因、表皮葡萄球菌2312基因、金黄色葡萄球菌nuc基因、铜绿假单胞菌ecfX基因、奇异变形杆菌ure基因序列为模板,分别设计特异性引物,建立多重PCR扩增体系并优化。收集临床血培养报阳标本200份,应用所建立的多重PCR法鉴定,并与传统血培养方法比较。结果多重PCR法可特异性扩增出10种病原菌目标DNA条带,200份报阳样本目标菌阳性预测值为60.5%,除传统血培养有1份漏检外,多重PCR与血培养法结果符合率为100%。结论多重PCR方法与传统鉴定方法相比,可大幅度缩短临床培养报阳后鉴定时间,其多种病原菌同时检测的优势,具有良好的临床应用前景。

摘要：[目的]克隆沙眼衣原体PmpH基因并进行生物信息学分析。[方法]以沙眼衣原体核酸检测阳性泌尿生殖道标本为研究对象,设计引物扩增PmpH基因,克隆、测序后获得其全长核酸序列,应用生物信息方法预测分析编码蛋白的理化性质、主要结构域、结构及B细胞抗原表位。[结果]PCR扩增出沙眼衣原体PmpH基因,克隆并测序后获得PmpH基因核酸序列,长度为3051 bp,预测PmpH蛋白理论分子质量为107.898 ku,等电点为6.05,该蛋白具有信号肽和2个结构域。PmpH蛋白二级结构主要为无规则卷曲,占比高达50.69%。预测该蛋白含有34条线性B细胞表位,其中氨基酸数大于7的有26个。[结论]克隆得到沙眼衣原体PmpH基因,预测PmpH蛋白分子量为107.898 ku,二级结构主要为无规则卷曲,含有34条线性B细胞表位(大于7个氨基酸的有26个)。

摘要：立足智慧城市建设背景下图书馆的智慧化转型问题,从泛在服务、精准画像、互联互通、人工智能等方面探讨智慧城市框架下智慧图书馆的建设实质。同时,汲取当前智慧图书馆建设案例中的经验做法,依托智慧城市建设,从发展设计层、技术实施层、目标效用层3个层面提出智慧图书馆建设规划路径,并在未来工作重心、互动形式、馆员队伍建设方面提出具体建议。

摘要：目的建立快速准确的肠球菌种属鉴定及万古霉素耐药基因检测的多重聚合酶链反应(multiplex polymerase chain reaction,MPCR)方法,并在人及动物源菌株中应用。方法针对肠球菌属、粪肠球菌、屎肠球菌、van A、van B、van C1、van C2/C3保守基因设计引物,建立肠球菌种属鉴定及万古霉素耐药基因型检测的MPCR方法;应用建立的MPCR方法检测98株人及动物源菌株菌种及万古霉素耐药基因,并比较MPCR方法检测结果与检测菌株的VITEK Compact 60自动微生物鉴定仪菌种鉴定结果及琼脂稀释法的万古霉素及替考拉宁药敏检测结果,分析MPCR方法检测结果与其他方法的一致性。结果成功建立了用于检测肠球菌属和常见肠球菌种及万古霉素耐药基因型的MPCR方法。MPCR方法和VITEK Compact 60自动微生物鉴定仪对98株检测菌株菌种鉴定结果一致;MPCR方法检测98株菌万古霉素耐药基因型与药敏检测其耐药表型相对应。结论建立的MPCR方法成功用于检测人及动物源肠球菌种属及万古霉素耐药基因型,为快速准确鉴别肠球菌种属及万古霉素耐药肠球菌耐药基因型提供方法,对于有效监测万古霉素耐药肠球菌,控制其传播、流行具有重要意义。