摘要：目的构建解脲脲原体UP3_c0006基因原核表达载体并表达蛋白。方法根据NCBI上公布的解脲脲原体UP3_c0006基因序列设计上、下游引物,以解脲脲原体基因组DNA为模板,PCR扩增目的基因,采用经酚氯仿法回收、纯化。BamHI和NotI酶分别对目的基因和原核表达载体pGEX-6P-2进行双酶切,酶切片段在T4连接酶作用下连接,连接产物经热休克法转化感受态大肠埃希菌XL1-Blue。转化菌接种至含氨苄青霉素的LB固体培养基过夜培养,进行菌落PCR筛选及测序验证。重组质粒转化菌用IPTG诱导3h,超声裂解菌体经GST Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白GST-UP3_c0006并进行SDS-PAGE鉴定。结果 PCR扩增UP3_c0006基因片段长327bp,构建的UP3_c0006原核表达载体转化XL1-Blue后进行菌落PCR鉴定,目的片段约为477bp,与预期相符。对重组菌扩大培养并提取质粒进行基因测序,结果与NCBI中UP3_c0006基因序列完全一致;诱导表达的重组蛋白纯化后进行SDS-PAGE鉴定,融合蛋白GST-UP3_c0006分子质量单位约为38×103,与预期相符。结论成功构建了pGEX-6P-2-UP3_c0006原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得融合蛋白的表达,该蛋白主要存在于重组菌超声裂解上清中。

摘要：目的构建ACBD3基因片段真核表达载体并表达蛋白,为研究其与肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308/Cpn0147相互作用的分子机制奠定基础。方法根据与肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308/Cpn0147作用的配体核苷酸序列设计引物,以HeLa细胞cDNA为模板,通过PCR获得ACBD3基因片段,与pcDNA3.1+/Flag质粒经双酶切后在T4连接酶作用下连接,构建表达载体pcDNA3.1+/Flag-ACBD3,经菌落PCR、双酶切及质粒测序鉴定后转染HeLa细胞,采用Western blot与间接免疫荧光法检测目的蛋白表达。结果 PCR扩增目的基因片段约883bp,与预期相符。经菌落PCR、双酶切验证及测序分析重组质粒构建成功。间接免疫荧光法检测重组质粒转染后的HeLa细胞,观察到表达的蛋白位于细胞胞浆;SDS-PAGE检测表达蛋白分子质量单位(Mr)为33.5×10~3,与预期相符。结论成功构建了pcDNA3.1+/Flag-ACBD3真核表达载体并实现目的蛋白的表达,为进一步研究其生物学功能及其与肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308/Cpn0147之间的相互作用奠定了基础。

摘要：目的针对Cpn0308基因建立检测肺炎衣原体的Taqman探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法。方法根据肺炎衣原体包涵体膜蛋白Cpn0308基因序列设计引物和Taqman探针,建立Taqman FQ-PCR检测体系,对反应体系进行优化,进行灵敏度、特异性、重复性评价;并与商品化肺炎衣原体核酸检测试剂盒检测临床标本进行对比分析。结果肺炎衣原体Taqman FQ-PCR方法的引物浓度300 nmol/L,探针浓度200 nmol/L,Mg^(2+)4.0 mmol/L为最优反应条件;灵敏度为8.36×102copies/μL;该法对常见几种呼吸道病原菌及沙眼衣原体无交叉反应;重复性试验中4个浓度变异系数均小于3%。自建方法与商品化试剂盒对呼吸道感染组、心血管疾病组及正常对照组标本检出率分别为10%vs 10%(χ~2=0.167,P>0.05),44.44%vs 40.74%(χ~2=0,P>0.05),6.67%vs 3.33%(χ~2=0,P>0.05),各组阳性率间差异无统计学意义;2种方法的总阳性率(16.54%vs 14.96%)比较差异无统计学意义(χ~2=0.071,P>0.05)。结论本研究建立的Taqman探针实时荧光定量PCR检测肺炎衣原体的方法灵敏度好,特异性高,重复性好,可应用于临床肺炎衣原体核酸检测。