摘要：目的筛选有效沉默KLF4基因表达的siRNA,观察KLF4基因沉默对人肝星状细胞HSC-LX2生物学行为的影响。方法设计并化学合成针对人KLF4基因的3对siRNA(siRNA1、siRNA2、siRNA3),转染人肝星状细胞HSC-LX2,以转染非特异siRNA作为阴性对照。采用实时荧光定量RT-PCR(Real-time RT-PCR)和Western blot方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表达情况,筛选出沉默KLF4效果最好的1个siRNA,将其转染入HSC-LX2后,用MTT法检测KLF4沉默对HSC-LX2增殖的影响。采用ELISA法检测细胞培养上清中的转化生长因子1(transforming growth factor,TGF-1)、白介素1(interleukin-1,IL-1)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)的表达情况。结果Real-time RT-PCR和western blot均显示siRNA3沉默效果最好。故后续试验均采用siRNA3沉默KLF4的表达。MTT实验结果显示,在转染siRNA3,12 h、24 h和48 h后,细胞活力出现明显下降。ELISA结果显示,转染siRNA3,48 h以后,TGF-β1、TNF-α、IL-1β表达量也明显降低。结论 siRNA3可有效沉默KLF4基因表达,KLF4基因沉默可以抑制HSC-LX2的增殖,影响其生物学行为,使细胞中的促进胶原表达的三种细胞因子TGF-1、TNF-α以及IL-1表达量下降。

摘要：目的探讨大鼠KLF4基因沉默,对大鼠肝星状细胞HSC-T6胶原代谢的影响及其机制。方法设计并构建针对大鼠KLF4基因的3个干扰质粒(p GPU6-1,p GPU6-2,p GPU6-3)以及阴性对照。采用实时荧光定量RTPCR(Real-time RT-PCR)和western blot的方法分析KLF4 mRNA和蛋白的表达情况,筛选出沉默最好的干扰质粒,将筛选出来的干扰质粒p GPU6-3,转染大鼠HSC-T6细胞。转染24 h和48 h后分别采用Real-time RT-PCR法和western blot的方法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、基质金属蛋白酶-13(matrix metalloproteinase-13,MMP-13)、基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)mRNA和蛋白的表达。Real-time RT-PCR法以GAPDH为内参照,用2-ΔΔCt法进行分析计算。western blot的方法以β-actin蛋白为内参照,进行分析。结果 Real-time RT-PCR结果显示,p GPU6-3转染大鼠HSC-T6细胞后,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TIMP-1相对于对照组的mRNA表达分别下降为0.358±0.038,0.298±0.041和0.478±0.048;而MMP-13 mRNA的表达则上升为1.712±0.034。Western Blot检测中,p GPU6-3转染大鼠HSC-T6细胞后,以β-actin为内参照,Ⅰ型胶原蛋白,Ⅲ型胶原蛋白和TIMP-1蛋白的表达分别下降为0.326±0.051,0.283±0.074和0.331±0.039;而MMP-13蛋白的表达则上升为1.273±0.038。结论 KLF4基因沉默可以显著减少大鼠HSC-T6细胞Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的表达,其机制与增加MMP-13表达,而抑制TIMP-1的表达有关。