摘要：非洲猪瘟在我国首次暴发至今已经3年多,给我国养猪业及其相关产业带来了严重的损失。本试验主要以非洲猪瘟病毒E183L基因编码的p54蛋白为研究对象,设计扩增截短E183L基因的引物,构建p54蛋白重组表达载体pET-28a(+)-p54,转化至感受态细胞BL21(DE3)中进行诱导表达,获得可溶性表达的重组p54蛋白,通过Ni柱得到良好纯化。之后免疫BALB/c小鼠,将免疫小鼠的脾脏与骨髓瘤细胞融合制备单克隆抗体,通过ELISA方法筛选和3次亚克隆共制备出2株能稳定分泌针对ASFV p54蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株。经ELISA测定抗体腹水效价在1∶100000~1∶1000000之间。Western blot检测表明单克隆抗体与p54蛋白能够特异性反应。经鉴定2株单克隆抗体亚型均为IgG2b,κ。该研究获得的单克隆抗体将为p54蛋白的生物学功能的研究和ASFV血清学检测奠定基础。

摘要：幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)铁蛋白是储存铁和维持细胞铁平衡的一种蛋白质,在不同生物中均有发现,但铁蛋白氨基酸序列同源性低,这为利用铁蛋白建立Hp分子生物学和免疫学检测方法提供了理论依据。为获得泛素蛋白(small ubiquitin-related modifier,SUMO)融合系统高效表达的可溶性Hp铁蛋白,根据GenBank中Hp铁蛋白基因序列,设计合成引物,PCR扩增Hp铁蛋白基因片段,构建重组克隆菌株,菌液PCR、双酶切和序列测定筛选阳性克隆。双酶切后回收目的基因,构建pET-28a-SUMO-Ferritin重组表达质粒,转化至DH5α。通过菌液PCR、双酶切和序列测定,获得阳性重组表达菌株pET-28a-SUMO-Ferritin/BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,并用镍离子螯合柱(Ni-NTA)纯化重组蛋白。然后,利用SUMO蛋白酶I切割融合蛋白,获得高纯度目的蛋白。最后,利用获得的高纯度重组蛋白免疫小鼠制备多抗。结果显示实验扩增出了501 bp的Hp铁蛋白基因。IPTG诱导重组原核表达菌株,SDS-PAGE检测显示在34 kDa处有一条与理论值相符的条带;Western blotting鉴定SUMO融合重组蛋白,结果显示它能与His抗体特异性结合。37℃、0.1 mmol/L IPTG诱导过夜,SUMO融合重组蛋白呈可溶性表达。将去除SUMO标签后的重组蛋白纯化,透析,获得高纯度重组蛋白,免疫小鼠后抗体水平为1∶25600。研究结果表明,利用SUMO融合系统可高效表达可溶性Hp铁蛋白,免疫小鼠制备多抗,为进一步获得Hp铁蛋白的单抗,建立Hp免疫学检测方法奠定基础。