摘要：豹蛙抗瘤酶(Onconase,ranpirnase,ONC)对体内外多种肿瘤有很强的杀伤作用,是当前全球重点研究的100种新药之一,为获得高表达与高活性的重组豹蛙抗瘤酶(Recombination onconase,rONC),根据成熟ONC的cDNA序列和毕赤酵母密码子偏好性设计基因并提高其GC含量,分泌信号肽采用酵母α交配因子的pre肽,分别构建表达载体pPIC9/ONC、pPIC9K/ONC和pPICZα-A/ONC,并转染毕赤酵母X-33、GS115和SMD1168,筛选阳性克隆并进行诱导表达。在摇瓶规模筛选最佳载体-宿主组合及优化培养条件之后,进行10 L规模最优培养基的筛选,发酵产物经双水相萃取偶联G50凝胶层析分离纯化。结果表明,pPICZα-A/X-33/ONC组合表达量优于其他组合,且在p H 5.5、23℃条件下诱导7 d,最高表达量达到13 mg/L;在10 L规模条件下,rONC于pH 5.5的低盐基础培养基(Lower basic salt medium,LBSM)、甲醇浓度0.25%条件下诱导7 d,最高表达量为180 mg/L;纯化后的rONC纯度≥95%,收率高于90%;生物活性检测发现,rONC在体外能杀伤多种癌细胞。初步建立了rONC的高效表达与纯化体系,为后续的功能和作用机理研究奠定了一定基础。

摘要：研究了不同载体-宿主菌组合对毕赤酵母重组蛋白表达量的影响。以豹蛙抗瘤酶(onconase,ONC)、IL-1α、IL-1β、IL-1Ra、人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)与ONC的融合蛋白即HSA-(Gly_4Ser_1)_3-ONC(简称HSA-ONC)等5种重组蛋白为报告蛋白,设计并合成了5种基因。分别插入3种酵母表达载体p PIC9、p PIC9K和p PICZα-A中,转化3种毕赤酵母受体菌X-33、GS115和SMD1168。筛选得到7种载体-宿主菌组合,在摇瓶规模进行诱导并定量。研究结果表明:5种外源蛋白在p PICZα-A/X-33组合中表达量最高,在p PIC9/SMD1168组合中最低。从重组蛋白表达量来说,p PICZα-A/X-33组合优于其他6种载体-宿主菌组合。

摘要：豹蛙抗瘤酶(Onconase,ONC),又称豹蛙酶,对多种肿瘤细胞和实体瘤具有显著杀伤作用,为得到高表达的ONC,利用HSA在毕赤酵母系统中的表达优势,将HSA和ONC融合进行毕赤酵母表达并分离纯化。设计融合基因HSA-(Gly4Ser1)3-ONC,简称HSA-ONC,构建至3种表达载体p PIC9、p PIC9K、p PICZα-A并分别转染X-33、GS115和SMD1168 3种宿主菌,在摇瓶和10L规模优化表达条件和双水相偶联柱层析分离纯化目的蛋白并测定其生物学活性。结果显示,在1 L摇瓶规模下,p PICZα-A/X-33/HSA-ONC组合的表达量优于其他组合,且在p H7,温度23℃条件下诱导10 d,表达量达到最高(235 mg/L)。在10 L规模进行不同培养基条件的发酵,r HSA-ONC于p H 7的低盐基础盐培养基(Low salt basic salt mediu m,LS-BSM),甲醇浓度0.25%条件下诱导10 d,表达量达到最高(2.02 g/L)。经双水相萃取偶联DEAE离子交换层析可得到纯度≥95%、收率高于70%的r HSA-ONC。生物活性检测发现,r HSA-ONC在体外能抑制多种癌细胞增殖。r HSA-ONC的表达量较r ONC提高1倍(同等摩尔量情况下),同时在体外抑制多种癌细胞增殖。