摘要：本研究旨在分离鉴定河南鸡群马立克病病毒（Marek’s disease virus，MDv）流行毒株，了解当前MDV分子进化特征并为鸡马立克病（MD）的有效防控提供参考。根据MDV基因组设计了meq、gE、gI、gB、pp38以及132～bp重复序列基因的特异性引物，应用PCR扩增和DNA测序分析对河南焦作土鸡群8份MD疑似病例进行了确诊，并通过鸡胚成纤维细胞（CEF）盲传培养和间接免疫荧光试验（IFA）分离鉴定了3个流行毒株，分别命名为HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103。结果显示，3个MDV分离株均为血清1型（MDV1）毒株，未发生禽网状内皮增生症病毒（REV）共感染，并且132-bp重复序列基因均为双拷贝。meq、gE和gI基因核苷酸序列比对分析发现，临床病例样本及3个MDV新分离株的meq基因与国内外温和毒或疫苗毒株的meq基因核苷酸序列同源性仅为64．7％～78．8％，但与MDV强毒株的同源性高达98．9％～100．0％；gE和gJ基因的核苷酸序列同源性均较高，分别为99．1％～99．9％和99．3％～100．0％。系统发生树分析结果表明，HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103与绝大多数此前分离的河南毒株及国内MDV强毒株同处于一个大的进化分支。研究结果表明，3个分离株HNJZ101、HNJZ102和HNJZ103很可能是当前河南土鸡群中流行的致病性MDV—1毒株，其确切的致病型及导致免疫失败的原因仍有待进一步深入研究。

摘要：为了建立一种用于猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)的特异、灵敏、快速检测方法,试验根据GenBank发布的PPV基因序列保守区片段设计了一套带生物素标签的特异性引物和FITC探针,以pET28a-NS1重组质粒为阳性模板将环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术与侧向流动层析试纸(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立了PPV-LAMP-LFD检测方法,对LAMP-LFD的反应温度、反应时间及胶体金标记FITC-mAb比例进行优化,分析该方法的敏感性和特异性,并检测其早期临床应用效果。结果表明:建立的PPV-LAMP-LFD检测方法最适反应温度为64℃,最佳反应时间为50 min;标记1 mL胶体金需要14μg FITC-mAb;该检测方法的最低检测限为1×10 copies/μL,比琼脂糖凝胶电泳和荧光定量PCR灵敏度高19倍;对猪伪狂犬病毒(PRV)、蓝耳病病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)和猪瘟病毒(CSFV)检测结果均呈阴性;早期临床应用显示可在猪感染PPV后4 h的血液中检出病毒。说明建立的PPV-LAMP-LFD检测方法具有灵敏、特异、快速、简便等优点。

摘要：为了快速准确地检测脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)污染、控制其危害,本研究制备了高灵敏度的DON单克隆抗体,并建立了间接竞争酶联免疫吸附(ELISA)快速检测方法。采用N,N′-羰基二咪唑(N,N′-Carbonyldiimidazole,CDI)一步法将DON与载体蛋白BSA及OVA偶联制备人工抗原。用DON-BSA免疫小鼠,并根据免疫效果在常规免疫方案中增加腹腔免疫进行改进,利用细胞融合技术,获得能稳定分泌DON单克隆抗体的杂交瘤细胞株1株2A3-E11。经鉴定该细胞株分泌的DON抗体为IgG1型,效价达1∶1.024×10^(6),IC_(50)为21.5079μg/L,亲和力可达9.064×10^(8) mol/L;与15-AcDON有233.7%的交叉反应,与其他结构类似物及常见真菌毒素未见明显交叉反应。基于该抗体建立的间接竞争ELISA检测方法检测范围为4.6968~98.4900μg/L,小麦样品中的加标回收率为90.509%~116.016%,变异系数为3.081%~7.928%。研制的间接竞争ELISA检测方法灵敏度高、结果可靠,可进一步应用于小麦等谷物样品中DON污染的检测,为DON的免疫学检测技术研发奠定基础。

摘要：为了鉴别猪瘟病毒(CSFV)野毒感染和疫苗接种,系统比较分析CSFV标准强毒株、疫苗株、不同基因亚型的野毒株的全基因组序列差异,设计一套分别针对猪瘟强毒与弱毒NS5B基因的环介导等温扩增(LAMP)引物,建立特异性的猪瘟强毒株与疫苗株的LAMP检测方法.LAMP扩增产物用罗丹明B指示剂或者琼脂糖凝胶电泳进行检测.该方法特异性好,比RT-PCR灵敏度高出1 000倍,且重复性稳定性良好,为快速准确地鉴别CSFV野毒感染和疫苗接种提供了有效的方法.

摘要：为快速检测猪伪狂犬病毒(PRV),利用PRV DBP基因上的一段序列设计并合成3对LAMP引物,采用一种新的荧光染料——罗丹明B衍生物作指示剂,该指示剂在反应前加到反应缓冲液里,通过优化反应条件,建立了可视化LAMP快速检测PRV的方法。结果表明,63℃下恒温反应40min可得到肉眼可视结果,颜色变成蓝色判定为阳性,仍然保持紫色判定为阴性,可视化LAMP结果与电泳结果一致。建立的可视化LAMP方法可以快速、直观、准确地检测PRV。

摘要：本研究克隆了b0,+AT-2的全长cDNA序列。基于NCBI发布的人和鼠b0,+AT序列,应用生物学软件进行序列比对后在同源区设计引物,获取cDNA片段;再利用RACE技术克隆了其全长cDNA序列。生物信息学分析显示:猪b0,+AT-2的全长1 488 bp,包括90 bp的3′非翻译区(UTR)和126 bp的5′UTR;编码区(CDS)编码423个氨基酸残基,分别和人、鼠b0,+AT以及猪b0,+AT-1有75.1%、71.9%和86.6%的同源性。

摘要：根据对虾白斑综合征病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28的基因序列设计合成4条特异性引物,以pMDT-VP28重组质粒为标准模板,通过优化反应体系和反应条件,建立了WSSV的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,测定LAMP对WSSV-DNA的最低检测限,并与巢式PCR进行了比较。结果显示,该LAMP方法的最佳反应温度为65℃,反应时间为60min;LAMP对WSSV的最低检测限为10copies/μL,而巢式PCR为100copies/μL,表明该LAMP方法的敏感性显著高于巢式PCR检测方法。因此,WSSV的LAMP检测方法比PCR更为简便、快速、灵敏,且无需昂贵的变温仪器,更适应水产养殖的现地检测,本研究为WSSV早期感染的快速检测提供了新方法。

摘要：为了建立一种用于猪细小病毒(PPV)7型的特异、灵敏、快速、简便检测方法,采用环介导等温扩增技术(LAMP)与侧向流动层析试纸(LFD)相结合,根据GenBank发布的PPV7保守区NS1蛋白基因序列设计1套带生物素标签的特异性引物和异硫氰酸(FITC)探针,以PPV7-pET28a重组质粒为阳性模板建立了PPV7-LAMP-LFD检测方法,对LAMP-LFD的反应温度、反应时间及胶体金标记FITC单克隆抗体(FITC-mAb)比例进行优化,分析该方法的敏感性和特异性。结果:建立的PPV7-LAMP-LFD检测方法最适反应温度为64℃,最佳反应时间为60 min;标记1 mL胶体金需要FITC-mAb量为15.6μg;该检测方法的最低检测限为1 copies/μL,其灵敏度比琼脂糖凝胶电泳和荧光定量PCR高10倍;对伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型、乙型脑炎病毒、猪瘟病毒和PPV1~6型病毒检测为阴性,特异性良好;不同批次引物和探针检测结果一致,重复性好;对86份血样的诊断结果与荧光定量PCR进行比对,LAMP-LFD检测方法的阳性率为9.30%(8/86),检测灵敏度为100%(8/8),特异性为100%(78/78),2种方法的符合率为98.83%(85/86)。本研究为PPV7感染的监测与防控提供了技术支撑。

摘要：病毒编码的microRNA(miRNA)在马立克病病毒(MDV)的复制、潜伏感染及诱导肿瘤发生中发挥重要的调控功能。血清1型MDV(MDV-1)编码的26个成熟体miRNA在基因组中形成3个基因簇,分别命名为Meq、Mid和LAT miRNA基因簇。本文利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,以超强毒株(vvMDV)国内代表株GX0101为研究对象,设计并合成一系列可实现LAT基因簇miRNA编辑缺失的特异性gRNA组合,成功构建了一株LAT基因簇miRNA缺失毒株GX?LAT-miRs-C21-15。经DNA测序分析、IFA鉴定及RT-qPCR分析,证实LAT基因簇miRNA被完全编辑缺失。该基因缺失毒株传代稳定性良好,miRNA的缺失不影响MDV的体外复制及相关基因表达。本研究基于CRISPR/Cas9系统,获得了稳定的LAT基因簇miRNA编辑缺失毒株,为后续相关miRNA的功能研究奠定了重要基础。

摘要：为了进一步了解传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白P22多肽抗原表位的功能,根据IBDVVP2蛋白的三维结构,设计合成编码P22多肽的基因序列,通过大肠杆菌密码子优化,并将基因序列P22串联二次合成并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株。用IPTG诱导P22基因的表达。表达纯化后的P22多肽经SDS-PAGE电泳和Western-blot分析及传染性法氏囊病毒快速检测试纸条检测。结果表明,P22表位多肽的分子质量约为16kD,并能被His单抗识别,用试纸条检测纯化的P22多肽,呈阳性反应结果。提示IBDV VP2蛋白P22多肽能与IBDV单抗特异性反应。