摘要：猪萨佩罗病毒(PSV)VP1蛋白是位于病毒粒子表面的结构蛋白,发挥主要的抗原效应。为了弄清PSV HNHB-01株VP1基因的表达与分子特征,本研究设计针对VP1基因的特异性引物,通过RT-PCR扩增获得VP1基因,并重组到真核表达载体pCAGGS上,经Western blot、间接免疫荧光鉴定,成功表达VP1蛋白。随后基于PSV HNHB-01株全基因序列以及VP1基因序列与其他参考毒株的基因序列构建遗传进化树,分析遗传进化关系。结果表明:实验室分离的HNHB-01株与2017年分离的HNXX-01株亲缘关系最近,与日本株JPSV-1315关系接近;HNHB-01 VP1基因与国内2016-2017年流行的毒株HNXX-01、PSV-A2、JXXY-a2的VP1基因高度同源,与国外2009年流行的日本毒株JPSV1315的VP1基因亲缘关系较近;HNHB-01株VP1氨基酸与HNXX-01株VP1氨基酸同源性最高,同源性为99.32%。三级结构分析表明,VP1蛋白存在3条位于蛋白结构外侧的抗原表位区,对应的氨基酸序列分别为20~30 aa、90~100 aa和265~275 aa。本研究为PSV感染的诊断与预防提供依据,并为今后研究VP1基因的功能和开发疫苗奠定基础。

摘要：本试验旨在采用CRISPR/Cas9技术获得整合素αV(IntegrinαV,ITGαV)及整合素β3(Integrinβ3,ITGβ3)基因敲除的猪睾丸(Swine testicle,ST)细胞系,进而在细胞水平上研究ITGαV及ITGβ3在猪δ冠状病毒(Porcine deltacorovirus,PDCoV)入侵过程中的作用及相互作用机制。根据GenBank上猪的ITGαV及ITGβ3基因序列分别设计三对引导RNA(sgRNA),并整合到LentiCRISPR‐V2载体上,与辅助质粒pSPA×2及pMD2.G共转染293 T细胞进行慢病毒包装,包装完成后感染ST细胞并用嘌呤霉素进行压力筛选。用T7酶进行酶切检测,选出编辑效率较高的细胞群体,进一步用有限稀释法筛选出单克隆敲除细胞系。对分离出的ST‐ITGαVKO(敲除ITGαV基因的ST细胞)及ST‐ITGβ3KO(敲除ITGβ3基因的ST细胞)的单克隆细胞系进行测序和Western Blotting鉴定,结果显示ITGαV与ITGβ3均被成功敲除。采用敲除细胞系进行PDCoV感染试验,结果表明敲除ITGαV、ITGβ3基因均可抑制PDCoV在ST细胞内的增殖,成功构建的ST‐ITGαVKO及ST‐ITGβ3KO细胞系为后续阐明ITGαV、ITGβ3在PDCoV入侵过程中的作用提供了细胞模型。

摘要：为了实现非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的快速检测,本研究建立了检测ASFV K196R基因的q PCR方法。按照K196R基因保守序列,设计1对特异性引物,建立并优化qPCR反应体系和反应条件,构建标准曲线,测定该检测方法的特异性、灵敏性和可重复性。结果显示,本研究建立的检测方法不与其他病毒的核酸样品产生交叉反应,检测灵敏度达10 copies/μL。变异系数小于2.5%,构建的标准曲线线性关系良好。上述结果表明,该检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,能够为ASF疫情防控提供技术支撑。

摘要：已知感染猪群的冠状病毒有猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)、猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)、猪呼吸道冠状病毒(PRCV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(PHEV);本研究拟建立针对这6种病毒的通用荧光定量PCR检测方法。依据NCBI公布的这6种猪冠状病毒序列,利用MEGA软件进行全基因序列比对,通过分析在ORF1b中找到1段长为196 bp的保守序列,设计兼并引物,建立了用于检测猪冠状病毒的通用荧光定量PCR检测方法;结果显示,该检测方法能扩增出6种猪冠状病毒,对PDCoV、PRCV、PHEV、SADS-CoV、TGEV的灵敏性均可达到101拷贝/μL,对PEDV的灵敏性可达到100拷贝/μL;与CSFV、PRRSV、PPV、PCV、PRV无交叉反应,特异性良好;组内和组间变异系数均小于2.2%,重复性良好。利用建立的检测方法对62份病料进行检测,检测出27份样品呈现猪冠状病毒阳性,而利用普通RT-PCR方法共检测出24份阳性样品。选择2份猪冠状病毒阳性样品进行克隆测序,在NCBI上进行比对,通过同源性分析,分别鉴定为PDCoV和PEDV感染。本试验建立的猪冠状病毒通用荧光定量PCR检测方法特异性、重复性好,敏感性高,能用于对猪冠状病毒的检测和流行病学调查,同时还可监测猪新型冠状病毒的出现。

摘要：为建立检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法,本试验参考GenBank中登录的猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)M基因、猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV)VP1基因、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)N基因和猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)N基因的序列,分别设计相应的引物,构建4种病毒的阳性质粒。以阳性质粒为标准品,通过优化反应条件和反应程序,建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法,并确定了该检测方法的特异性、灵敏性和重复性。结果显示,该方法具有较高的灵敏性,对PSV、TGEV、PDCoV和PEDV的最低检测量分别为1.37×10^(2),1.44×10^(2),1.51×10^(2)和1.56×10^(2)拷贝/μL。而扩增猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)、猪瘟病毒(swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒Ⅱ型(porcine circovirus-2)PCV-2、猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)和猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV),结果均呈阴性,具有良好的特异性。重复性试验结果显示,在同等条件下扩增4种病毒的阳性质粒,3次均出现同样的目的条带。应用建立的方法检测了采集的48份腹泻猪的小肠组织和粪便样品,结果检测出2份PSV、7份PDCoV和11份PEDV,与单重RT-PCR检测结果的总符合率为91.66%。同时发现2份PSV和PDCoV混合感染,3份PEDV和PDCoV混合感染,2种检测方法对混合感染检测结果相一致。对2份阳性样品的PCR产物进行测序,结果与检测结果相符合。本试验建立了检测猪主要腹泻病毒的多重RT-PCR方法,为临床检测PSV、PDCoV、TGEV、PEDV和流行病学调查提供了便捷有效的方法。

摘要：猪星状病毒(porcine astrovirus,PAstV)属于星状病毒科,是哺乳动物星状病毒属家族成员,临床上主要引起仔猪呕吐、腹泻等症状,且常与其他病原混合感染。PAstV衣壳蛋白(capsid protein,Cap)与宿主细胞受体结合,诱导机体产生中和抗体,是开发PAstV疫苗的靶蛋白。为制备抗猪星状病毒5型衣壳蛋白的兔源多克隆抗体,本研究通过DNA Star软件对PAstV5 Cap进行抗原性分析,选择出抗原优势区域ORF2开放阅读框1~642 bp(642 bp),构建原核表达质粒pET32a-Cap-642,测序结果正确后将其转化至大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导,重组蛋白以包涵体形式表达,大小约为43 ku。重组蛋白经尿素透析法纯化,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体。间接ELISA方法测定多克隆抗体效价为1∶51 200,间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western-blot)结果显示抗PAstV5 Cap多克隆抗体能够特异性地识别PAstV5感染猪肾近曲小管上皮细胞(LLC-PK1)中表达的天然抗原;同时将抗PAstV5 Cap多克隆抗体进行了初步应用,结果表明该多抗具有良好反应性。本研究为PAstV5检测方法的建立以及PAstV5衣壳蛋白功能的研究奠定了基础。

摘要：IL-18作为一种多效性细胞因子,在机体免疫应答及各种生理功能中发挥着重要的调节作用,根据猪IL-18基因序列设计1对引物,将编码猪IL-18的成熟蛋白基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacDual中,并在C端融合6个组氨酸标签以利于纯化,然后转化到含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac中,发生转座作用。将重组质粒转染昆虫细胞,SDS-PAGE可检测到分子量为18 kDa左右的重组蛋白,Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗猪IL-18抗体发生特异性反应。纯化后蛋白能明显促进猪T淋巴细胞转化,表明所表达的IL-18具有较高的生物活性。此研究为进一步开发研制新型免疫佐剂奠定了基础。

摘要：【目的】建立快速、特异、灵敏的猪萨佩罗病毒(porcine sapelovirus,PSV)TaqMan实时荧光定量(RT-qPCR)检测方法,为临床快速检测PSV提供新方法。【方法】参照GenBank中PSV的全基因序列,针对PSV 5′端保守区设计1对特异性引物,PCR扩增目的片段,将目的片段克隆至pMD-18T载体,构建阳性重组质粒,并以阳性质粒标准品为模板,建立标准曲线。在此基础上,设计特异性引物与探针,进行反应体系和反应条件优化,建立PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,并对方法的敏感性、特异性和重复性进行验证。应用建立的方法对2018-2019年在河南不同地区猪场收集的83份样品(粪便样品39份,肠道样品44份)进行检测。【结果】建立了PSV TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法的灵敏度为3.88×10^(1)拷贝/μL;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒均无交叉反应,特异性良好;批内与批间变异系数均小于1.0%,重复性较好。临床样品检测结果表明,TaqMan RT-qPCR检测PSV呈阳性的样品有31份(22份粪便样品,9份肠道样品)检出率为37.3%(31/83),显著高于普通PCR检测结果(检出率12.0%(10/83))。【结论】建立了TaqMan RT-qPCR检测方法,该方法灵敏度高,特异性好。

摘要：目的建立快速、特异的分离鉴定大肠杆菌O157∶H7及其3个主要毒力基因(hylA、eaeA和stx2基因)的多重PCR方法。方法根据GenBank公布的大肠杆菌O157∶H7菌体抗原rfbE基因、鞭毛抗原fliC基因、溶血素(hlyA)基因、紧密黏附素(eaeA)基因和志贺样毒素2(stx2)基因为靶基因,设计5对特异性引物,在同一扩增体系中进行PCR,优化反应体系,测定特异性和灵敏度,并进行了临床样品的检测。结果该方法扩增目的基因片段分别为327bp、247bp、494bp、384bp和779bp,特异性和灵敏度均高,细菌纯培养物的检测灵敏度为104cfu/mL。结论初步建立了快速、灵敏、特异的检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7及其3个毒力基因的多重PCR方法,可用于临床动物携带大肠杆菌O157∶H7的分子流行病学调查及食品微生物检测。

摘要：目的通过测定120株不同来源肠球菌耐药性分布情况,毒力基因cylA、efaA、gelE、esp、ace和AS的携带率,旨在了解肠球菌耐药现状和毒力基因分布情况,为选择临床治疗方案和探索肠球菌致病机制提供参考。方法设计6对特异性引物,应用PCR方法对分离到的120株肠球菌进行6种毒力基因检测,同时用纸片扩散法对11种常用抗生素进行耐药性试验。结果 120个肠球菌分离株对抗生素均具有3重以上的耐药性,且不同来源菌株的多重耐药性有明显差异,其中以病死猪内脏分离株多重耐药性最为严重;总体上,上述分离株对林可霉素耐药率最高,为达96.00%(115/120),对环丙沙星、卡那霉素、四环素和达福普汀的耐药率均达到50%以上,而对替考拉宁的耐药率最低,仅为0.83%(1/120)。6种毒力基因cylA、efaA、gelE、esp、ace和AS在受试菌株中的阳性检出率依次为39.17%、56.67%、68.33%、23.33%、26.67%和13.33%;不同来源的肠球菌毒力基因携带率不同,且携带毒力基因数量也有明显差异,其中,来自病死猪内脏的肠球菌分离株携带毒力基因的比例较高,且有超过50%的菌株同时携带4种毒力基因及以上。结论肠球菌的耐药率和多重耐药性与毒力基因携带阳性率有一致性,且与菌株来源关系密切,因此对这一传统意义上的机会性病原体值得深入研究其中的因果关系。