摘要：目的建立一种基于重组酶介导的等温扩增(recombinase-aided isothermal amplification, RAA)技术的斯氏并殖吸虫快速核酸检测方法,并对其检测效果进行初步评价。方法从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,提取基因组DNA进行分子鉴定。以斯氏并殖吸虫线粒体细胞色素c氧化酶亚基I基因(cytochrome coxidase 1, cox1)基因序列作为靶序列设计、制备、筛选引物及探针。以河南省济源市和洛阳市宜阳县斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA检测方法验证。以含斯氏并殖吸虫cox1基因序列的不同浓度重组质粒和斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA为模板进行荧光RAA扩增,评价其检测灵敏度;应用建立的荧光RAA法同时检测卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、华支睾吸虫和日本血吸虫基因组DNA,评价其检测特异性。结果从溪蟹样本中分离出斯氏并殖吸虫、卫氏并殖吸虫和三平正并殖吸虫囊蚴,经分子鉴定和系统进化分析确认其与Gen Bank中并殖吸虫标准株基因序列具有同源性。成功建立了斯氏并殖吸虫荧光RAA检测方法,可在5 min内扩增到河南省济源市和洛阳市宜阳县采集的斯氏并殖吸虫囊蚴基因组DNA,而阴性对照无扩增。以重组质粒为模板,荧光RAA法最低检出限为10拷贝/μL重组质粒,且均在5 min内出现阳性扩增;以基因组DNA为模板,可检测到的最低模板DNA浓度为10 pg/μL,且均在10~15 min内出现阳性扩增。荧光RAA法检测卫氏并殖吸虫、三平正并殖吸虫、日本血吸虫和华支睾吸虫基因组DNA结果均为阴性。结论成功建立了一种基于荧光RAA技术的快速、敏感、特异的斯氏并殖吸虫核酸检测方法,在斯氏并殖吸虫病流行区溪蟹现场快速检测与虫种鉴定中具有潜在应用价值。

摘要：目的建立一类荧光重组酶聚合酶(recombinase polymerase amplification,RPA)扩增的田鼠巴贝虫快速检测方法并对该方法进行评价。方法选择细胞色素B基因为靶序列,设计3组引物及荧光探针建立田鼠巴贝虫的检测方法并优化引物。设置37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃等6个温度梯度进行反应温度条件优化。将基因组DNA稀释至1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL等7个浓度梯度进行该方法的敏感性评价,采集恶性疟及间日疟患者血液样本进行特异性评价。取445200、89040、17808、3561.6、712.32、142.46、28.49、5.7、1.14、0.23不同田鼠巴贝虫载量的样本进行虫密度最低检测限实验。选取16例临床发热患者的血液样本进行荧光RPA与巢式PCR检测,评价结果一致性。结果建立的荧光RPA法可特异扩增出150 bp的田鼠巴贝虫目的片段,最佳反应温度为39℃。该方法针对基因组DNA的检测敏感性最低可达10 fg/μL,不同田鼠巴贝虫密度样本的最低检测限量为0.23个/μL。该方法在对恶性疟、间日疟患者血液样本的检测中均未出现交叉反应。荧光RPA与巢式PCR各检测16例临床发热患者血液样本,均检出9例田鼠巴贝虫阳性,7例田鼠巴贝虫阴性,结果一致。结论荧光重组酶聚合酶扩增检测田鼠巴贝虫方法敏感性强、特异性好,有望应用于巴贝虫感染的快速检测及风险监测。