摘要：目的:探讨肝素酶反义寡核苷营酸对肝毒酶mRNA表达的影响。方法:食管癌EC9706细胞分6组培养,5组分别用设计合成的4条封闭肝素酶不同基因位点的反义寡核苷酸(ASODN1、ASODN2、ASODN3、ASODN4)及1条无关寡核苷酸(N-ODN)转染,另1组不转染。采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中肝素酶mR-NA表达情况。结果:4条肝素酶反义寡核苷酸转染的EC9706细胞中肝素酶mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05),但均显著低于无关寡核苷酸组(P<0.05)。结论:肝素酶反义寡核苷酸序列可抑制食管癌EC9706细胞中肝素酶mRNA表达。

摘要：根据siRNA设计原则,针对人葡萄糖神经酰胺合成酶(GCS)mRNA序列设计并合成编码siRNA的寡核苷酸序列,并将其克隆入小干扰RNA表达载体,构建重组质粒。将重组质粒转人耐长春新碱的胃癌细胞株(SGC7901/VCR),通过RT-PCR、免疫细胞化学等方法检测转染细胞GCS的表达水平,以生长曲线观察细胞生长情况。结果构建的GCSsiRNA表达载体释放出的片段与预期结果一致;转染SGC7901/VCR细胞后,可使细胞中GCSmRNA及其蛋白表达受抑制,细胞生长减慢。提示GCSsiRNA载体的成功构建及其对GCS表达和细胞生长的抑制,使其可能成为肿瘤基因治疗的一种新手段。

摘要：目的 观察RNA干扰沉默NEDD9对胃癌BGC823细胞增殖、凋亡、侵袭等生物学行为的影响.方法 设计并合成3对NEDD9基因干扰序列,预实验选取siNEDD9-2作为最佳干扰siRNA进行实验,检测转染胃癌BGC823细胞的增殖、凋亡及侵袭能力的变化.结果 所有转染细胞NEDD9mRNA和蛋白的相对表达量均低于对照组,且有时间和浓度依赖性;细胞的增殖抑制率明显高于对照组;细胞凋亡数和细胞凋亡指数均明显高于对照组;细胞的体外侵袭能力也受到明显抑制.结论 NEDD9-siRNA能显著降低胃癌BGC823细胞中NEDD9表达,抑制胃癌细胞增殖、迁移及侵袭,并诱导其凋亡.

摘要：目的构建MMP-9反义RNA真核表达载体。方法提取胃癌组织总RNA,按照GenBank中检索的MMP-9基因cDNA序列,设计并合成反义MMP-9基因片段引物,进行逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),先将扩增产物克隆至pGEM-T载体,再将其反向亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1中,然后对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果PCR扩增出的反义片段与预期长度相符。构建的MMP-9反义RNA表达质粒pcDNA3.1-MMP-9分别作PCR及双酶切(BamH和Hind)鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与反义MMP-9序列设计完全一致。结论成功构建了MMP-9反义RNA真核表达载体pcDNA3.1-MMP-9,为进一步研究MMP-9蛋白分子的生物学功能和以MMP-9为靶点的恶性肿瘤的基因治疗研究奠定了基础。

摘要：目的:观察小分子干扰RNA(siRNA)对人食管癌EC9706细胞中血管内皮生长因子C(VEGF-C)表达的抑制作用。方法:根据VEGF-C cDNA已知序列,设计并体外转录合成3条siRNA,将它们分别导入载体质粒中,用脂质体介导分别转染EC9706细胞,以无关序列转染和正常EC9706细胞为对照。采用免疫细胞化学SP法、半定量RT-PCR和原位杂交技术分别检测上述各组细胞中VEGF-C蛋白和mRNA的表达。结果:正常细胞对照组和无关序列转染组均有大量VEGF-C蛋白阳性颗粒和mRNA阳性条带,而在siRNA转染的3组中,仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒和较弱的mRNA阳性条带,与正常细胞对照组和无关序列转染组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:VEGF-C siRNA能有效抑制食管癌EC9706细胞中VEGF-C的表达,可望成为一种抗淋巴管生成的新方法。

摘要：目的利用siRNA抑制人食管癌EC9706细胞中VEGF-C基因的表达。方法针对VEGF-CmRNA设计了3条siRNA,并构建相应的表达质粒,将质粒转染食管癌EC9706细胞,筛选稳定表达株,利用RT-PCR和原位杂交技术分析siRNA对细胞中VEGF-CmRNA的降解作用;免疫组织化学法分析细胞中VEGF-C蛋白的表达;利用裸鼠进行体内成瘤性实验,免疫组织化学法检测瘤组织中VEGF-C的表达。结果siRNA能明显降低食管癌EC9706细胞中VEGF-CmRNA和蛋白的表达,稳定转染的3个siRNA组细胞仅有少量VEGF-C阳性表达颗粒和无阳性条带,与无关序列组和正常EC9706细胞组相比,差异均有统计学意义(P<0.01);裸鼠体内的成瘤实验,3个siRNA转染组瘤组织中VEGF-C蛋白的表达也明显减少,与正常EC9706组无关序列组相比,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论靶向VEGF-CmRNA的siRNA能在体内外有效抑制VEGF-C的表达,可用于食管癌的基因治疗。

摘要：目的:构建并鉴定TIMP1绿色荧光蛋白真核表达载体。方法:提取胃癌组织总RNA,用TIMP1基因引物进行RT- PCR,将扩增产物克隆至pGEM -T载体,PCR鉴定及测序证实后,BamHⅠ和HindⅢ双酶切pGEM- T- TIMP1重组体,回收TIMP1,再将其亚克隆到绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP -C3中,并对阳性克隆进行酶切鉴定和测序分析。结果:构建的pEGFP C3TIMP1表达载体分别作PCR及双酶切鉴定,证实其中有目的片段完整插入,插入片段测序结果与TIMP1序列设计完全一致,将其转染人胃癌BGC823细胞后,TIMP1的表达定位在细胞胞浆内。结论:成功构建了TIMP1绿色荧光蛋白真核表达载体,为TIMP1的肿瘤靶向治疗研究奠定了基础。

摘要：目的：构建大鼠基质金属蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）小干扰RNA的真核表达质粒pRNAT．U6．2 siRNA。方法：依据siRNA设计原则确定以序列447～465nt、522～540nt、142～160nt为TIMP-1 siRNA靶序列，体外分别合成两端含BamHI和XhoI酶切位点的编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火后克隆于pGEM—T载体，r17和SP6为引物进行PCR鉴定；双酶切pGEM—T将其定向克隆到siRNA表达载体pRNAT—U6．2，用pRNAT—U6．2的插入鉴定引物进行PCR鉴定，阳性重组质粒测序。结果：DNA测序证实合成的并被克隆人真核表达载体pR—NAT．U6．2的siRNA插入序列与设计完全符合。结论：TIMP-1 siRNA表达载体构建成功，为后期研究TIMP-1 pRNAT—U6．2 siRNA作用、意义及效果奠定了实验基础。

摘要：目的:探讨组织蛋白酶B(CB)反义寡核苷酸(ASODN)对CB mRNA表达的影响。方法:将食管癌EC9706细胞分5组培养,5组分别用设计合成的3条封闭CB不同基因位点的反义寡核苷酸(ASODN1、ASODN2、ASODN3)及1条无关寡核苷酸(N-ODN)转染,另1组不转染(空白对照组)。采用完整细胞原位杂交技术观察各组EC9706细胞中CB mRNA表达情况。结果:3条CB ASODNs转染的EC9706细胞中CB mRNA表达均下调,差异无统计学意义,但均明显低于N-ODN组及空白对照组。结论:CB ASODN可抑制食管癌EC9706细胞中CB mRNA表达,为临床预防食管癌等恶性肿瘤浸润转移奠定理论了基础。

摘要：目的:探讨Smo siRNA对人食管癌EC9706细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2表达的影响。方法:设计并合成Smo siRNA-3,转染食管癌EC9706细胞后,分别采用RT-PCR和Western blot法检测细胞中Smo、bcl-2 mRNA和蛋白的表达;采用TUNEL法及流式细胞术检测细胞凋亡,分析凋亡指数(AI)和凋亡细胞比例。以未转染、无关序列siRNA转染和转染试剂的细胞作对照。结果:与各对照组相比,Smo siRNA-3转染细胞24、48和72 h后EC9706细胞中Smo、bcl-2 mRNA的表达均明显降低(P<0.05),以转染72 h降低最显著(P<0.05)。与各对照组相比,Smo siRNA-3转染72 h后细胞中Smo、bcl-2蛋白的表达均明显降低(F=151.310、143.190,P<0.001),AI增加(F=66.270,P<0.001),早期和晚期凋亡细胞比例均增加(F=101.100、334.990,P<0.001)。结论:Smo siRNA可能通过抑制细胞中Smo基因表达,进而下调bcl-2表达,促进EC9706细胞凋亡。