摘要：为筛选表达量高且免疫原性强的红斑丹毒丝菌表面保护性抗原A(SpaA)的抗原片段,本研究根据该菌SpaA的结构和功能区将其设计为6个子片段和1个全长片段,采用PCR技术从红斑丹毒丝菌HG-1菌株中扩增出SpaA的7个抗原基因片段,利用原核表达系统克隆并表达后采用SDS-PAGE和western blot检测表达及纯化情况。结果显示,获得7个重组蛋白,分别命名为rSpaA1~rSpaA7,其表达量占菌体总蛋白的17.44%~25.38%,其中rSpaA1、rSpaA2、r SpaA5以包涵体形式表达,r SpaA3以可溶性蛋白形式表达,而rSpaA4、rSpaA6、rSpaA7两种表达形式同时存在。纯化后,rSpaA1~rSpaA7的纯度介于84.22%~93.72%,浓度为0.89 mg/mL~3.25 mg/mL。Western blot结果显示,7个重组蛋白均显示出良好的反应原性,其中rSpaA1、rSpaA3、rSpaA4的反应原性更强。本研究实现了对红斑丹毒丝菌SpaA的分段及其全长的表达和纯化,为SpaA保护性抗原片段的筛选及猪丹毒亚单位疫苗的研发奠定基础。

摘要：为筛选多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)亚单位疫苗的优势保护性抗原,本研究根据GenBank中登录的Pm基因序列,设计相应引物,经PCR扩增Pm torA、prX、gpmA和thiB基因片段,分别克隆于原核表达载体pET28a中,构建各重组表达质粒,经测序鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,利用IPTG诱导表达,采用His6标签蛋白纯化试剂盒纯化获得4个重组蛋白rTorA、rPrX、rPGAM和rThiB,同时利用透析膜制备rTorA的粗提蛋白(rTorA-C)。SDS-PAGE检测结果显示,分别在91 ku、25 ku、32 ku及41 ku处出现目的条带,表明4个重组蛋白均正确表达,其中rTorA主要以包涵体形式表达,少量表达在上清中;rPrX、rPGAM和rThiB主要以可溶性形式表达;各重组蛋白的表达量占菌体总蛋白的7.44%~61.46%,各重组蛋白纯化后的纯度为76%~98.15%,浓度为0.15 mg/mL~4.56 mg/mL。Western blot检测结果显示,分别在上述4个位置处出现特异性条带。将4个纯化蛋白和rTorA-C分别与MontanideTM ISA 201 VG佐剂混合制成亚单位疫苗,免疫小鼠后分别于首免前、首免后14 d、二免后14 d(首免后28 d)采血,分离血清,通过间接ELISA方法检测各组小鼠抗体水平;二免后15 d采用4倍半数致死剂量(LD50)A型Pm强毒A5株菌液进行腹腔注射攻毒,观察并记录小鼠死亡及发病情况至21 d。ELISA检测结果显示,各重组蛋白免疫组小鼠的IgG抗体水平均随免疫次数的增加而升高,与PBS对照组相比差异均极显著(P<0.01)。攻毒试验结果显示,PBS对照组小鼠攻毒后24 h内开始发病,10 d内全部死亡(10/10);发病小鼠主要症状为精神萎靡、食欲减退或废绝,被毛凌乱,对外界刺激无明显反应等;对死亡小鼠剖检,各组织器官主要表现为出血为特征的败血症的剖检变化。各重组蛋白免疫组小鼠中,也出现了不同程度的发病或死亡。rTorA、rTorA-C、rPGAM、rThiB和rPrX免疫组小鼠的免疫保护率分别为60%、40%、100%、20%和0。本研究首次在相同条件下对Pm 4个重要重组抗原蛋白的免疫保护效力进行了对比分析,筛选出的rPGAM和rTorA具有作为亚单位疫苗靶抗原的潜力,为Pm亚单位疫苗候选保护性抗原蛋白的筛选奠定基础。

摘要：为提高纤维素的降解效率,将两种不同的纤维素酶基因在乳酸杆菌中融合表达,实现双纤维素酶在乳酸杆菌中的高效表达。根据两纤维素酶的基因序列设计两对引物,并在两基因间引入一段连接肽。通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)分别扩增得到两纤维素酶基因CelL15和CelL73,将其融合后连接到乳酸杆菌分泌性表达载体pMJ67中,构建重组表达质粒pMJ-CelL15-CelL73,电转化入乳酸杆菌Lactobacillus casei,利用红霉素MRS平板筛选阳性克隆,通过PCR验证获得了分泌表达双纤维素酶的重组乳酸杆菌。电泳实验结果表明重组乳酸杆菌成功表达了1个约为83 kD的融合蛋白。平板酶活力检测发现重组乳酸杆菌能明显降解底物中的羧甲基纤维素钠,培养液上清中纤维素酶酶活力可达1.25 U/mL。

摘要：为制备和筛选副猪嗜血杆菌(HPS)具有免疫保护效力的抗原因子重组蛋白,本研究根据GenBank中已登录HPS基因序列,设计引物,分别克隆其OapA、Hps0675(包括全片段和2个子片段)、Hsp60、OmpP2、HbpB、GAPDH、Hps06257和D15抗原因子的10个基因片段,分别将其克隆入pET28a质粒构建重组表达质粒并转化大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达。SDS-PAGE检测结果显示,除OapA外,其他9个重组蛋白均正确表达,其表达量占菌体总蛋白的10.20%~31.90%。除rGAPDH以可溶性和包涵体两种形式表达外,其他8个重组蛋白均以包涵体形式存在。Western blot鉴定结果显示,rHbpB、rD15、rHps06257反应原性最强,rGAPDH、rHsp60、rOmpP2反应原性中等,r Hps0675-1、r Hps0675-2、rHps0675反应原性最弱。以His标签蛋白纯化试剂盒纯化后,9个重组蛋白的纯度在90.72%~98.72%,浓度在1.082 mg/mL~7.936 mg/mL。本研究实现了HPS 9个重要抗原因子的克隆表达和纯化,首次在相同条件下对其反应原性进行了对比分析,为其亚单位疫苗候选保护性抗原蛋白的筛选奠定基础。