摘要：目的为了提高微量样本中miRNA的检测通量和检测效率,本文建立了一种能够同时准确定量两种miRNA的双重实时荧光定量PCR(real time fluorogenic quantitative PCR)检测体系,并通过实际样本检测验证其应用于体液鉴别的效果。方法设计适用于miRNA双重检验的相关引物及探针并优化实验体系组分,建立基于TaqMan技术的miRNA双重实时荧光定量PCR检测体系并验证其特异性、灵敏度和可重复性;使用此检测体系对58份不同体液样本中的miR-451a与miR-21-5p进行检测,并借助miR-451a与miR-21-5p的比值鉴定法评估该体系的体液鉴别能力;使用该检测体系样本数据确定的最佳截断值对模拟案件样本进行鉴别。结果优化的检测体系能够实现对血液与非血液、月经血与外周血的100%区分,同时可以实现对模拟案件样本的准确鉴别。结论该双重实时荧光定量PCR检测体系将时间和材料成本均缩短至原来的一半,为后续建立更多重的实时荧光定量PCR检测体系并应用于体液鉴别打下了基础。

摘要：本文建立了毛干蛋白单氨基酸多态性(single amino acid polymorphism,SAP)的质谱检测方法,以DNA测序验证方法的准确性,并设计多组样本检验SAP鉴定的重现性。对来自6个人的25份毛干样本的SAP鉴定结果进行分析,并与毛干来源人的血液外显子测序结果相比较,对于不一致位点进一步使用Sanger法测序确定SAP对应的SNP分型。共设计四组重复性实验测试,对不同直径/生长部位毛干的分型结果进行了一致性验证。通过设计的376对引物进行PCR扩增,成功检测了522个SNP分型,其中32个(6.1%)与前期外显子测序分型不一致,152个(29.1%)为外显子测序中未检测的分型,338个(64.8%)与外显子分型结果一致。四组重复性实验中,组内SAP鉴定准确率平均值为93.6%(95%CI:92.8%~94.5%),鉴定重现率平均值为96.0%(95%CI:94.3%~97.6%)。在所有25份样本中,有283个SAP位点在至少两个样本中检出,其中23个位点在全部样本中都被检出。因此,毛干蛋白SAP鉴定方法具有较高的准确性和重现性,得到的23个高检出率SAP位点可作为候选位点构建有效位点组合,呈现出潜在的法医学应用价值。

摘要：目的 利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)技术建立可同时检测miR-888和miR-891a的体系,并评估其在精液鉴定中的应用价值。方法 通过设计不同荧光修饰的报告基团的水解探针实现对miR-888和miR-891a的双重ddPCR检测,对5种体液(外周血、月经血、精液、唾液、阴道分泌液)共75份样本进行检测,采用Mann-Whitney U检验进行差异性分析,通过ROC曲线分析评估miR-888和miR-891a区分精液的能力并获得鉴别的最佳截断值。结果 该体系双重检测与单独检测结果差异无统计学意义,检测灵敏度可达到0.1 ng总RNA,批内与批间变异系数均小于15%。经双重ddPCR检测,精液中miR-888和miR-891a的表达量均高于其他体液。经ROC曲线分析,miR-888的AUC为0.976,最佳截断值为2.250 copies/μL,判别正确率为97.33%;miR-891a的AUC为1.000,最佳截断值为1.100copies/μL,判别正确率为100%。结论 本研究成功建立了双重ddPCR检测miR-888和miR-891a的方法,体系的稳定性和重复性良好,可用于精液鉴定,miR-888和miR-891a均具有较高的精液鉴别能力,且miR-891a的判别正确率更高。

摘要：目的构建一套猪的STR复合扩增体系,并进行体系验证。方法筛选出猪的12个STR基因座:SW240、S0386、S0655、PigSTR4C、PigSTR5C、PigSTR7B、PigSTR11B、387A12F、PigSTR13E、PigSTR14A、PigSTR15A、PigSTR17A,并结合性别位点Amelogenin基因座设计荧光标记引物,优化反应条件,构建出复合扩增体系。结果成功构建了一套包含猪的12个STR基因座和1个性别位点的复合扩增体系。体系的最佳条件为10μL体积,60℃退火温度,28次循环。体系的准确性、一致性、均衡性、稳定性、种属特异性、多态性均良好,灵敏度达0.125ng。12个基因座的累积个体识别率为0.999999999999961,累积随机匹配概率为3.9208×10^-14,累积非父排除率为0.9952。结论本文构建的猪复合扩增体系可以用于涉及猪的个体识别和亲子鉴定的案件鉴定。

摘要：目的基于规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)/CRISPR关联蛋白质系统(Cas)技术建立检测血液特异性血红蛋白α(HBA)mRNA的方法,以准确、快速地鉴定血液样本。方法本研究通过设计和筛选血液特异性HBA mRNA上的CRISPR RNA(crRNA)短片段,基于CRISPR/Cas技术原理建立了SHERLOCK-HBA检测方法,对5种体液(包括外周血、月经血、唾液、阴道分泌液、精液)共79份样本进行检测以评价所建方法鉴别血液的能力,并通过种属特异性实验、灵敏度实验、模拟混合斑检测、模拟降解样本检测、实际案件样本检测等进一步验证实验体系的法医学应用能力。结果该方法检测人源血液的相对荧光单位(RFU)值显著高于非血液(P<0.0001)以及非人源血液样本(P<0.0001),对血液RNA的检出灵敏度可达1×10^(-3) ng,且可成功检测出混合斑迹以及陈旧降解斑迹中的微量血液成分。结论本研究成功建立了一种基于CRISPR/Cas技术的SHERLOCK-HBA检测体系,能准确、灵敏地鉴定血液,操作简单、快速,为快速识别血液类样本提供了新的思路和参考。

摘要：设计并实现了一种基于BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)的生物序列比对方法,它可以应用于法庭科学多种遗传标记的检索比对。引入BLAST算法并设计合理的打分函数,使其在兼容序列多态性比如线粒体DNA比对的同时,可以有效地进行长度多态性比如常染色体STR的比对。实验表明,采用这种方法可以实现不同序列的有效比对,输出准确的有序结果集,具有较高的比对效率。

摘要：二代测序相较于毛细管电泳技术(capillary electrophoresis, CE),以其体系中可容纳更多的基因座而在法医学实践中更具潜力和价值。MiSeq FGx^(TM)系统是专为法医学设计研发的一个测序平台,其配套试剂盒Forenseq DNA Signature Prep kit具有较高的灵敏度和准确度。本实验利用该试剂盒对41份家系样本进行测序,结果发现,58个STR基因座中有26个基因座出现了等位基因亚型,等位基因总数目增加了79个;与CE一致性上,有1份样本在DYS392基因座出现缺失,推测应与试剂盒引物扩增效率有关,另外还有8份样本在DXS7132基因座出现与CE不一致的情况,通过Sanger测序以及使用其他软件分析后,排除扩增失败,确认是生物信息分析问题。实验证明,二代测序相比于毛细管电泳技术有很多优势,不过目前在数据分析方面还存在一些问题,需要不断优化完善所涉及的生物信息分析方法。随着未来相关技术与标准的不断完善,二代测序会逐渐应用于法医学实践中。

摘要：目的短串联重复序列(short tandem repeat,STR)遗传标记在人类个体识别、亲缘关系分析、动植物物种鉴定、农作物品种登记及杂交种纯度鉴定、临床疾病诊断等领域应用广泛。本团队在利用Illumina二代测序平台进行法医STR基因座靶向测序时,发现部分基因座正反向测序深度不平衡的现象,影响测序数据质量。本文通过研究不同STR基因座的重复区和扩增子区域中碱基含量与测序深度的关系,探究该现象的原因。方法利用STRSeqTyper122二代测序STR分型试剂盒对70份无关个体的DNA样本进行STR基因座复合扩增和文库构建,使用Mi Seq FGx平台进行测序,下机数据使用ForensicTyper软件进行分型和测序深度统计,随后分析测序深度与重复区和扩增子区域中碱基含量之间的关系。使用同样方法对前期发表的Ion PGM^(TM)平台STR测序数据进行分析。结果分析117个STR基因座的测序深度发现,基因座正向测序深度占总测序深度的比例与扩增子区域的TC碱基占比紧密相关:扩增子中TC比例低于40%时,随着TC含量降低,正向测序深度占比有明显的升高趋势;扩增子中TC比例高于60%时,随着TC含量升高,正向测序深度占比有明显下降趋势。同样分析Ion Torrent平台70份样本的32个STR测序数据,未观察到类似现象。结论MiSeq FGx平台在测序STR基因座时存在链偏好性,正反向测序深度与碱基TC比例密切相关。以上研究可为二代测序STR基因座选择、引物和扩增子设计、数据分析与解读提供重要参考,服务临床医学、法医学、植物学等领域应用。

摘要：本文建立双重数字PCR检测miR-891a-5p和内参基因RNU6b鉴定精液的方法,并评估其对实际案件的检验能力。通过设计5’端不同荧光修饰的TaqMan MGB探针,建立检测miR-891a-5p和RNU6b的双重数字PCR方法,对5种体液(包括精液、外周血、月经血、唾液、阴道分泌液)共107份样本进行检测,以非参数检验和ROC曲线分析评价所建方法鉴别精液的能力;进行灵敏度试验并制备不同比例的混合斑、模拟降解精斑等测试体系的准确性。结果表明,精液miR-891a-5p表达水平显著高于其他体液(P<0.0001),其与内参基因RNU6b的表达情况证实方法能够实现100%的精液鉴定。所有测试条件下的样本(包括0.008μL的微量精液、按1︰100与其他4种体液混合的精斑以及室外放置14 d、紫外照射24 h或洗涤过的精斑等)均被正确鉴别。本研究成功建立了一种基于数字PCR技术准确、灵敏地鉴定精液的方法,显示出良好的鉴别能力和应用前景,可在法医实际检案中广泛应用。

摘要：目的 建立一种高效、准确的鉴别月经血与外周血的方法体系并探究该体系的应用能力。方法 设计miR-451a、miR-21-5p的引物、探针,建立并优化基于TaqMan技术的qPCR检测体系;对58份样本(20份月经血、20份外周血、6份唾液、6份精液、6份阴道分泌液)中miR-451a与miR-21-5p的表达情况进行检测,探索候选miRNA分子在5种体液中的表达规律;最终建立区分目标体液的鉴别方法并用模拟案件样本对其准确性进行验证。结果 本研究所建立体系及方法可实现血液与非血液、月经血与外周血100%准确区分。结论 本研究基于TaqMan qPCR技术成功建立了运用miR-451a/miR-21-5p表达量比值鉴别月经血与外周血的方法体系,该体系鉴别能力良好,有望应用于实际法医案件中。