摘要：目的建立一种反向斑点杂交方法(reverse dot blots,RDB)以检测小鼠肝炎病毒。方法用MHV四个毒株分别感染L929细胞,收获病毒提取RNA并逆转录成cDNA;根据MHV保守区基因组序列设计引物和探针,将上游引物5'端用生物素标记。进行PCR扩增,应用PCR产物进行反向斑点杂交,优化杂交条件,进行稳定性、特异性和灵敏度实验,建立反向斑点杂交法。用此法和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)对41只小鼠进行检测。RDB检测结果阳性样本进行T载体克隆测序。结果试剂条4℃保质期为8个月。分别检测MHV、金黄色葡萄球菌、沙门菌和乙型肝炎病毒,仅MHV为阳性,RDB特异性为100%,且MHV PCR产物最低检测限为5 ng/μL。41只小鼠经本方法检测后,有5只MHV阳性,分布于3个群,而ELISA检测结果有5只阳性,分布于2个群,阳性样本T载体克隆测序结果与RDB检测结果一致。结论该方法具有简洁明了、稳定可靠、特异性好、灵敏度高等优点,可应用于实验动物小鼠肝炎病毒的检测。

摘要：目的建立一种简洁稳定、特异灵敏的检测泰泽病原体(Tyzzer’s organism)的反向斑点杂交方法(reverse dot blot,RDB)。方法根据泰泽病原体16S rDNA保守基因组序列设计引物和特异性探针,上游引物用生物素标记,进行PCR扩增,建立反向斑点杂交方法,用此法进行了特异性和灵敏度实验,同时,用RDB、ELISA和IFA对41只小鼠、38只大鼠进行了检测。结果 RDB特异性强,最低检测限为4.5 ng/μL。对79例实验动物的检测中,与ELISA检测结果一致性为100%,阳性率是7.59%(6/79);与IFA一致性为92.4%(73/79),IFA阳性率是0%。结论建立了PCR扩增与分子杂交相结合的准确、灵敏、特异的泰泽病原体反向斑点杂交检测方法。